本发明专利技术公开了人凝血因子Ⅸ毕赤酵母表达载体及构建方法和应用，其步骤是：根据hFIX基因序列，用RT-PCR技术从人肝细胞中中克隆出hFIX全长cDNA序列，构建用于毕赤酵母表达的融合了酵母α-factor信号肽和全长hFIX序列的酵母表达质粒pPIC9K-hFIX。继而构建酵母表达质粒pPICZαA-hFIX，在此基础上构建四种酵母菌hFIX高活性突变体。得到的hFIX酵母表达载体凝血活性明显高于标准hFIX。其中一种突变体经50L中试发酵研究，蛋白纯化产物分泌表达量为702mg/L，为以后低成本产业化生产治疗B型血友病的高效hFIX产品打下了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
人凝血因子K突变体毕赤酵母表达载体及构建方法和应用
本专利技术属于分子生物学领域。具体涉及人凝血因子IX (hF IX)突变体毕赤酵母表达载体，同时还涉及人凝血因子IX (hF IX)突变体毕赤酵母表达载体的构建方法，还涉及人凝血因子IX (hF IX)突变体毕赤酵母表达载体在生产hF IX蛋白中的应用。
技术介绍
凝血因子IX研究进展凝血因子IX是凝血“瀑布反应”中重要的促凝集因子。其主要由肝实质细胞合成， 以酶原的形式分泌到外周血中。当各种内外因素激活内源性凝血反应后，凝血因子IX被激活，发生一系列的凝血连锁反应，最终形成血块、血栓，从而达到止血的目的。凝血瀑布反应中内源性凝血途径由因子ΧΠ活化而启动。当血管受损，内膜下胶原纤维暴露时，可激活ΧΠ为 XD a,进而激活XI为XI a。XI a在Ca2+存在时激活IX a(活化的hF IX)，IX a再与激活的VDI a、 PF3、Ca2+形成复合物进一步激活因子X。Xa与因子V、Ca2+和PF3 (血小板第3因子，为血小板膜上的磷脂)共同组成凝血酶原复合物，最终启动凝血酶和纤维蛋白的形成。当某些指导凝血因子IX合成的基因发生各种突变时，凝血因子IX不能正常合成，或合成量减少，或活性下降，都会使得内源性的凝血反应受到不同程度的影响，从而导致活化的部分凝血酶时间(Activated Partial Thrombopla stin Time, APTT)时间延长，引发一系列的凝血功能异常。这种疾病就是人类B型血友病(Hemophilia B)。人类B型血友病，又称凝血因子IX缺乏症(Factor IX Defciency)、克里斯多式症 (Chris tmas Disease)。它是一组由于缺乏凝血因子IX所引起的性连锁隐性遗传性疾病,X 染色体隐性遗传，因而常见于男性。导致B型血友病的发生主要是因为指导合成凝血因子 IX的基因发生了插入、倒位、缺失和点突变等异常，直接的后果就是合成的凝血因子IX量减少或活性降低，或者两者兼备。根据凝血因子IX活性相当于标准活性的百分比(hFlX :C), 可以分为轻、中和重型血友病。临床上治疗重型B型血友病的方法常见的就是凝血因子IX输入替代疗法和基因治疗，由于基因治疗存在着副作用大、效果不佳的缺点，在临床应用上仍属于试验阶段，所以常用的治疗方法主要是凝血因子补充替代疗法。临床实践证明，补充所缺乏的凝血因子是控制血友病出血最有效的措施。替代疗法的原则是根据hF IX的半衰期、稳定性，以及出血严重程度、手术大小及范围，有针对性地选择合适的血液制品、剂量和给药方法。替代疗法包括输入新鲜血浆(已不常用)、冷沉淀物凝血酶原复合物(含因子IX、X、I1、νπ)和基因工程生产的hF IX药物(如Benef IX)等。但是血浆和血浆提纯的凝血因子的安全性受到了很大的质疑，反复输入很容易感染HIV、HBV、HCV和梅毒等，有报道称有5%左右的血友病人因输血引起各种感染。所以应用重组凝血因子是一个很好的选择，它避免了感染的隐患，但其高昂的价格和国内重组hF IX药品短缺使得病人在用药上很不便。 hF IX的编码基因位于X染色体长臂末端，大小约为10kb，转录的mRNA大小约为 2500bp。hF IX主要是由肝脏实质细胞合成的，细胞合成的hF IX由461个氨基酸残基组成，血液中游离的hF IX由不带信号肽片段的415个氨基酸残基组成。hF IX是单链糖蛋白，含有约17%的糖基化修饰，分子大小根据糖基化程度不同为55-75kD。当发生内源性凝血时，其转化为活化的hF IXChF IX a)。hF IX a由一个轻链和一个重链组成，具有丝氨酸蛋白酶活性。血液中凝血因子IX的正常浓度为3-5mg/L。从已有的资料看，大部分报道的hF IX突变都会引起其活性的降低，从而罹患B型血友病。点突变也是B型血友病遗传学上的病理机制之一。但是，也有报道某些氨基酸的改变会增强其凝血活性。例如在轻链Gla区域的第86氨基酸V(缬氨酸)突变为A(丙氨酸)时，特异性凝血活性会增高至原来的2倍，原因可能是由于加强了和活化态凝血因子IX 的结合的能力；在轻链EGF-2区域的V107突变为A时，和活化态凝血因子VDI的结合能力是野生型的36倍左右，因此怀疑能提高凝血因子IX的活性；在重链水解酶区的R338突变为A 后，可以显著改变其蛋白酶活性达到原来的2倍左右。因此，我们选择了这几个突变位点对 hF IX进行突变研究。毕赤酵母表达载体研究进展目前可以表达重组蛋白的成熟的蛋白表达系统主要有巴斯德毕赤酵母(Pichia. past oris)蛋白表达系统、中华仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)蛋白表达系统和昆虫细胞蛋白表达系统等，但是都有各自的优缺点。Pichia. pastoris基因表达系统经过近二十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中。作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E. coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。目前已经有300多种外源蛋白在Pichia. pastoris基因表达系统得到有效表达，其中已高效表达了 HBsAg、TNF、 EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，被认为是目前最有效的酵母表达系统。研究中所应用的野生型hFlX毕赤酵母表达载体pPIC9K-hFlX分子量较大，有 IOOOObp,以现在的点突变技术，没有一种Pfu和Taq酶可以完成延伸如此大的质粒，因而我们同时构建了 pPICZ a A-hF IX进行点突变。pPICZ a A载体也是一种分泌型毕赤酵母表达载体，它只有3600bp，加上目的片段后也只有6000bp左右，现在的Fast-Pfu酶可以准确的扩增8000bp以下的片段，故突变技术上比较成熟；再者pPICZ a A的酵母信号肽-factor部分含有Xhol位点，同时下游也有Notl位点，正好可以连入从pPIC9K-hF IX切下的目的基因； 最后,pPICZ a A载体有Zeocin抗性位点,可以很容易用Zeocin进行筛选,并可利用Zeocin 浓度不同，筛选出多拷贝转化子。本部分多个点突变采用单点突变累积法，即将测序验证的，突变成功的质粒 再次进行其他位点的突变，这样一步步达到累积突变的目的。毕赤酵母中试发酵工艺研究进展毕赤酵母发酵产物的累积不会对自身产生毒副作用，且毕赤酵母的表达菌株很容易从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，不影响外源基因的表达水平。这注定了毕赤酵母具有可用于高密度发酵的巨大潜力。中试工艺是连接研发和生产的一个重要台阶，是科技成果向生产力转化的一个重要环节。多年来，中试在我国并未得到足够的重视，“中试空白”现象比较严重。然而，成果产业化的成败主要取决于中试的成败,科技成果经过中试,产业化成功率可达80%，而未经过中试产业化成功率只有30%，只有通过了中试才能进行量产，可见中试工艺的重要性。毕赤酵母是近十年比较流行的新的高效表达系统。目前，用该系统成功表达的外源基因到2000年己有220种，其中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离重组的质粒pPICZαA?hFⅨ?R338A，其序列为SEQ?ID?NO.20所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离重组的质粒pPICZ a A-hF IX -R338A，其序列为SEQ ID NO. 20所示。2.一种分离重组的质粒pPICZ a A-hF IX -V86A-R338A，其序列为SEQ ID NO. 21所示。3.一种分离重组的质粒pPICZa A-hFlX-V107A-R338A，其序列为SEQ ID NO. 22所示。4.一种分离重组的质粒 pPICZaA-hFlX-V86A-V107A-R338A，其序列为 SEQ ID NO. 23 所示。5.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，周俊，戴永刚，王震宇，吴尘宇，成采莲，唐文心，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：
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