【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种胞内结构域、靶向cd19的嵌合抗原受体及应用。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t(chimeric antigen receptor t,car-t)细胞技术是通过体外基因改造技术，将针对特异性抗原的单链抗体可变区(single chain antibody variablefragments，scfvs)序列表达于患者的t细胞表面，进而靶向并杀伤肿瘤细胞。car的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区(通常来源于抗体抗原结合区域的scfv段)、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号区。细胞膜外部分是从单克隆抗体中纯化的抗原靶向部分，该抗体由单链可变片段(scfv)(重链和轻链可变区的融合蛋白)组成，直接决定药物治疗的靶向性；研究表明，胞内结构域介导的信号转导对car-t细胞的扩增及功能尤为重要。
2、嵌合抗原受体(cars)、嵌合共刺激受体和工程t细胞受体(tcrs)可以通过基因转移引入t细胞，以重定向特异性并促进启动效应t细胞功能的信号通路。cars将抗原识别结构域与细胞内信号结构域连接起来，以重定向t细胞的特异性和功能。cd28的胞内结构域对于将抗原识别转化为抗肿瘤功能至关重要，且cd28的胞内结构域通过增强效应t细胞的活化和分化以及控制调节性t细胞的发育和功能，在调节免疫反应中起关键作用。由此可见，胞内结构域在信号转导过程中扮演着极其重要的角色，通过分子生物学技术，优化胞内结构域将对于提高car-t细胞的功能具有重要的实际意义。
3、前期研究表明，cd28分子的胞内
技术实现思路
1、本专利技术的目的是使靶向cd19的嵌合抗原受体在t细胞中更加高效、稳定表达，提高靶向cd19的car-t细胞对于表面表达cd19的肿瘤细胞的杀伤能力。
2、为此，本专利技术提供了一种靶向cd19的嵌合抗原受体胞内结构域car-cd28-195p，其特征在于：所述胞内结构域car-cd28-195p的氨基酸序列如seq id no.11所示。
3、本专利技术还提供了一种编码上述胞内结构域car-cd28-195p的核苷酸序列，述核苷酸序列如seq id no.12所示。
4、本专利技术还提供了一种靶向cd19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体中包含如权利要求1所述胞内结构域car-cd28-195p。
5、具体的，上述嵌合抗原受体包括从n端到c端顺次拼接的信号肽、抗cd19抗体单链可变区、cd8铰链区、cd28跨膜区、胞内结构域car-cd28-195p、胞内共刺激域4-1bb和cd3ζ链。
6、具体的，上述抗cd19抗体单链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述cd8铰链区的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述cd28跨膜区的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述胞内共刺激域4-1bb的氨基酸序列如seq id no.13所示；所述cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.15所示。
7、具体的，上述上述抗cd19抗体单链可变区的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述cd8铰链区的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述cd28跨膜区的核苷酸序列如seq idno.8所示；所述胞内共刺激域4-1bb的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述cd3ζ的核苷酸序列如seq id no.16所示。
8、具体的，上述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.19所示；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如seq id no.20所示。
9、本专利技术还提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体以ptk-ef 1α-kan载体为骨架，含有seq id no.20所示的编码核苷酸。
10、本专利技术还提供了一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞由上述嵌合抗原受体转染哺乳动物的免疫细胞获得。
11、具体的，人或其他哺乳动物的免疫细胞选自脐带血、单采血、外周血或ipsc来源的t细胞、nk细胞、nkt细胞、αβt细胞、γδt细胞、cd4+t细胞或cd8+t细胞。优选为外周血来源的t细胞。
12、本专利技术提供的嵌合抗原受体或重组慢病毒载体或免疫细胞可用于制备治疗或预防肿瘤的药物。所述肿瘤为b细胞急性淋巴细胞白血病或其他以cd19作为治疗靶点的疾病。其他以cd19作为治疗靶点的疾病优选为b细胞淋巴瘤。
13、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
14、本专利技术提供的这种种靶向cd19的嵌合抗原受体胞内结构域car-cd28-195p序列经过优化后，流式免疫荧光染色结果显示，car分子在t细胞的表达无显著影响，而对cd19阳性的b细胞白血病或淋巴瘤可起到更加良好的杀伤作用。
15、本专利技术提供的这种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞是将分离得到的免疫细胞激活2-10天后再感染表达嵌合抗原受体的慢病毒，通过体外实验检测表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的功能，所选择的细胞系为细胞膜外高表达cd19靶点的细胞系，对表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的杀瘤效果评价更为科学。
16、以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。
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1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体胞内结构域CAR-CD28-195P，其特征在于：所述胞内结构域CAR-CD28-195P的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.一种编码如权利要求1所述胞内结构域CAR-CD28-195P的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
3.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体中包含如权利要求1所述胞内结构域CAR-CD28-195P。
4.如权利要求3所述靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括从N端到C端顺次拼接的信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8铰链区、CD28跨膜区、胞内结构域CAR-CD28-195P、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链。
5.如权利要求4所述靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗CD19抗体单链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述胞内共刺激域4-1
6.如权利要求4所述靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
7.一种重组慢病毒载体，其特征在于：所述重组慢病毒载体以PTK-EF1α-Kan载体为骨架，含有权利要求6所述核苷酸。
8.一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞由权利要求3-6任意一项所述嵌合抗原受体转染哺乳动物的免疫细胞获得。
9.如权利要求8所述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞选自脐带血、单采血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞。
10.如权利要求3-6任意一项所述嵌合抗原受体或如权利要求7所述重组慢病毒载体或如权利要求8-9任意一项所述免疫细胞在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向cd19的嵌合抗原受体胞内结构域car-cd28-195p，其特征在于：所述胞内结构域car-cd28-195p的氨基酸序列如seq id no.11所示。
2.一种编码如权利要求1所述胞内结构域car-cd28-195p的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如seq id no.12所示。
3.一种靶向cd19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体中包含如权利要求1所述胞内结构域car-cd28-195p。
4.如权利要求3所述靶向cd19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括从n端到c端顺次拼接的信号肽、抗cd19抗体单链可变区、cd8铰链区、cd28跨膜区、胞内结构域car-cd28-195p、胞内共刺激域4-1bb和cd3ζ链。
5.如权利要求4所述靶向cd19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗cd19抗体单链可变区的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述cd8铰链区的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述cd28跨膜区的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐瑶，代金金，周睿婕，谭振林，王梦怡，周润龙，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：
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