本发明专利技术内容为人源非依赖于泛素化及ATP的一种结构上更加稳定的蛋白酶体激活因子REGgamma突变体REGgammaLinker的构建方法。该方法主要通过分子克隆的手段，分别进行俩次不同的PCR，将原有的REGgamma的60位到107位的氨基酸用六肽Linker（GAVSAG）来取代，从而得到一种更加稳定的突变体。并且对该突变体蛋白进行了原核表达，纯化以及晶体筛选以及结构解析。通过与母体蛋白结构与功能上的实验分析，证明通过该本发明专利技术的方法可以获得结构稳定，对蛋白酶体的激活功能没有影响，从而对以后对REGgamma蛋白在生物学上的研究，以及药物开发等方面提供了理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及结构生物学领域，涉及到一种更加稳定的人源蛋白酶体激活因子的构建方法以及其晶体结构的解析。
技术介绍
蛋白酶体系统在真核细胞蛋白质蛋白质降解中起着重要作用，在细胞周期的调控，转录，信号转导，凋亡以及免疫应答方面都起着关键的作用。蛋白酶体主要通过泛素依赖和非泛素依赖的俩种途径对蛋白质进行降解。20S蛋白酶体是降解蛋白质的核心部分，由不同的亚单位组成的环状柱形结构，俩外环由7种不同的α亚单位组成，俩内环有7种不 通的β亚单位组成，其中蛋白酶活性位于β亚单位上。蛋白酶的活性需要由蛋白酶体激活因子来激活。目前报道发现的蛋白酶体激活因子主要有ΡΑ700，ΡΑ28和ΡΑ200.对于ΡΑ200的研究目前还不是很清楚，ΡΑ700是一类依赖于泛素化，具有ATPase活性的激活因子，它可以与20S蛋白酶体相结合，形成26S复合物，来降解细胞内的绝大部分需要降解的蛋白质。另外一种蛋白酶体激活因子是ΡΑ28，也称为REG，是一种不依赖于泛素化和不具有ATPase活性的蛋白酶体激活因子。REGgamma已经被证明能够激活蛋白酶体来促进一些蛋白质的降解，目前研究表明，REGgamma能够介导一些细胞内重要蛋白质的蛋白酶体途径的降解，包括SRC-3，依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶的抑制子Ρ21，Ρ16，Ρ19。而且研究表明REGy可以通过促进MDM2介导的P53的泛素化来降解肿瘤抑制因子P53的降解。同时REGgamma也是一种细胞周期调控因子，其敲除REGgamma基因的小鼠在体型生长方面明显受到抑制,REGgamma能够减少细胞增殖，促进细胞凋亡，从而暗示其在癌症的发生中也可能起着重要的作用。同时REGgamma还可以介导HCV核心蛋白的降解,从而说明在病毒感染及清除方面，REGgamma也起着重要的作用。目前通过传统的方法无法获得该蛋白酶体激活因子的晶体，因此，我们通过分子克隆手段构建了一种新的突变体，通过该方法构建的突变体，能够很容易的得到其晶体，并且解析了其结构。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过分子克隆的手段，构建一种更加稳定的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker，并且解析该突变体的晶体结构。为以后对该激活因子的功能研究提供结构基础，从而为进一步研究该激活因子对于癌症研究，以及药物开发提供理论基础。本专利技术提供的不依赖泛素及ATP的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker的构建方法经如下步骤得到第I、根据REGgamma的核苷酸序列以及人工设计加入的Linker氨基酸序列，设计两对引物，分别为FPl :GCGAATTCATGGCCTCGTTGCTGAAGTTGGAT, SEQ ID No. 2 和RPl:GCCTCGAGTCAGTACAGAGCTTCTGCATTGCT, SEQ ID No. 3 ;及linkerl:GGAGCCGTGAGCGCAGGCCTGAAAAGCAACCAGCAG, SEQ ID No. 4Iinker2:GCCTGCGCTCACGGCTCCGTGGATCTGAGTTAGGTC, SEQ ID No. 5以REGgamma的全长核苷酸序列为模板，分别利用两对引物进行PCR反应，扩增取代氨基酸前端片段和后端片段，两个PCR反应中使用的引物分别为FPl/linker2，RPl/linkerl ;通过两个PCR反应’已经将linker前后的核苷酸序列分别克隆完成；利用FP1/RP1 —对引物，以前面反应得到的产物作为模板进行PCR，得到linker取代60到107位氨基酸的REGgamma的全长核苷酸序列；第2、将上步反应中得到的linker取代的PCR产物利用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，同时载体质粒pGEX-6p-l也利用相同的酶进行双酶切反应，以使PCR产物和质粒形成相同的黏性末端；在了4连接酶的作用下，将酶切后的目的基因片段连接到pGEX-6p-l的质粒载体中，形成重组质粒pGEX-REGgammaLinker ；第3、通过酶切鉴定该突变体基因已经连接到表达载体以后，并送测序公司进行测序以确定构建成功。本专利技术在突变体REGgammaLinker的构建基础上，进一步提供了突变体蛋白REGgammaLinker的原核表达纯化、晶体筛选以及结构解析方法，该方法的具体步骤如下第I、将以上构建的重组质粒pGEX-REGgammaL inker转化到表达菌株E. col iBL21DE3 中；第2、挑取单克隆,接种到5ml经过灭菌且添加100mg/l Ampicllin抗生素的LB 液体培养基中，在37°C摇床中过夜培养12个小时后，转接到IL经过灭菌且添加IOOmg/IAmp i c 11 in抗生素的LB液体培养基中，在37 °C摇床中培养约4个小时后，测其OD约为O. 7，加入终浓度为O. 5mM的异丙基硫代半乳糖苷IPTG使目的蛋白进行诱导表达，16°C下诱导18个小时后离心5000rpm离心20min收集菌体，收集到的菌体用PBS缓冲液重新悬浮，PBS缓冲液组成是137mMNaCl,2. 7mM KCl，4· 3mM Na2HP04,1. 4mM KH2P04 ；第3、悬浮好的菌液经超声波破碎并利用高速离心18000rpm 45min进行离心，离心后的上清液利用GST亲和层析柱进行初步纯化,而后利用PreScission在柱上进行酶切从而除去GST标签；酶切洗脱下的目的蛋白浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪，经过阴离子交换柱Resource Q和分子筛凝胶色谱柱Superdex20010/300GL进行纯化,得到经过电泳检测纯的目的蛋白；第4、通过以上纯化步骤获得电泳纯的REGgammaLinker突变体蛋白样品，将此蛋白溶液加入Amicon超滤浓缩管中于4000rpm的转速下离心浓缩浓缩过程中将蛋白酶溶液中的150mM NaCl利用不含NaCl但其他组分相同的缓冲液进行稀释，降低蛋白酶溶液中的离子浓度，使NaCl浓度低于IOmM ;利用紫外吸收法测定蛋白质的浓度；将测定浓度后的蛋白酶溶液利用缓冲液稀释至10mg/ml后，利用悬滴结晶法于O. lMTrisU9%PEG3350w/v, O. 2M Li2SO4, 15%Glycerol, 5% 异丙醇，ρΗ8· 5 的结晶条件下获得REGgammaLinker突变体蛋白的晶体；第5、REGgammaLinker突变体蛋白晶体的X射线衍射数据收集步骤如下第5. I、首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从脱水以后的晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的单一晶体，并迅速使用Oxford Cyrosystem公司的冷却系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180°C ;使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据；第5. 2、收集到晶体的X射线衍射数据后，按照以下步骤进行相应的数据处理及结构解析 首先使用HKL2000软 件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser，利用分子置换方法，以其同源的人源蛋白酶体激活因子REG α为置换模型TOB code :1AV0进行分子置换以确定其相位；通过PHENIX，COOT等本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种不依赖泛素及ATP的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker的构建方法，经如下步骤得到：第1、根据REGgamma的核苷酸序列及欲取代氨基酸后加入的linker，设计两对引物，分别为：FP1:GCGAATTCATGGCCTCGTTGCTGAAGTTGGAT，SEQ？ID？No.2RP1:GCCTCGAGTCAGTACAGAGCTTCTGCATTGCT，SEQ？ID？No.3；及linker1:GGAGCCGTGAGCGCAGGCCTGAAAAGCAACCAGCAG，SEQ？ID？No.4linker2:GCCTGCGCTCACGGCTCCGTGGATCTGAGTTAGGTC，SEQ？ID？No.5；以REGgamma的全长核苷酸序列为模板，分别利用两对引物进行PCR反应，扩增取代氨基酸前端片段和后端片段，两个PCR反应中使用的引物分别为：FP1/linker2，RP1/linker1；通过两个PCR反应，已经将linker前后的核苷酸序列分别克隆完成；利用FP1/RP1一对引物，以前面反应得到的产物作为模板进行PCR，得到linker取代60到107位氨基酸的REGgamma的全长核苷酸序列；第2、将上步反应中得到的linker取代的PCR产物利用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，同时载体质粒pGEX？6p？1也利用相同的酶进行双酶切反应，以使PCR产物和质粒形成相同的黏性末端；在T4连接酶的作用下，将酶切后的目的基因片段连接到pGEX？6p？1的质粒载体中，形成重组质粒pGEX？REGgammaLinker；第3、通过酶切鉴定该突变体基因已经连接到表达载体以后，并送测序公司进行测序以确定构建成功。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马克·巴特兰姆，饶子和，李平，李鑫，王莹莹，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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