一种提高木质纤维素基质水解酶产量的方法技术

本发明专利技术公开提供了一种提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素水解辅助酶蛋白在毕赤酵母中异源表达量的方法。本发明专利技术通过毕赤酵母密码子偏好的特性，对来源于黑曲霉Aspergillus niger的木聚糖酶(XynC)基因进行密码子优化，其优化后的核苷酸序列(AxynC)经人工合成，并构建重组毕赤酵母表达载体pPIC9K‑AxynC和pPICZαA‑AxynC。利用两步电击转化法，构建高产木聚糖酶的重组毕赤酵母，即将线性化的pPIC9K‑AxynC转化毕赤酵母GS115，获得了一株产酶能力较强的菌株。以该高酶活菌株作为宿主菌进行第二次电击转化，将线性化的pPICZαA‑AxynC电击转化该菌株，获得了一株高产木聚糖酶的双质粒重组毕赤酵母。通过检测表明，经过密码子优化的木聚糖酶基因能够在毕赤酵母中成功表达，而且利用两步电击转化法构建的高产木聚糖酶重组菌能稳定高效生产木聚糖酶，摇瓶水平酶活达到了410U/mL，发酵上清液中蛋白含量达到了0.37mg/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
详细地说，本专利技术涉及一种提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关的辅助酶蛋白在重组毕赤酵母中表达量的方法及其双质粒重组毕赤酵母的构建。
技术介绍
半纤维素酶、纤维素酶和木质纤维素基质水解相关的辅助酶都是一类多组分酶蛋白的总称，能够共同作用将难以被生物利用的木质纤维素水解为利于被生物利用的葡萄糖，因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。半纤维素酶和纤维素酶都属于糖苷水解酶，能够降解木质纤维素的半纤维素酶酶系包括随机切割木聚糖主链产生木寡糖的β-D-1,4内切木聚糖酶、β-D-1,4外切木糖苷酶和侧链水解酶(α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等)。纤维素酶系至少包括三类组分，分别为葡聚糖外切酶(CBH)，葡聚糖内切酶(EG)以及β-葡萄糖苷酶(BG)，其中EG作用于纤维素非结晶区，水解β-1,4糖苷键，可将线性纤维素多聚物截断生成大量纤维素小分子；CBH水解1,4-β-D-糖苷键，作用于线性纤维素多聚物末端，生成纤维二糖分子；BG则将纤维二糖水解成为葡萄糖。辅助酶主要包括AA9、植物扩展蛋白Expansin和膨胀因子Swo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用双质粒重组毕赤酵母表达系统提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白产量的方法，其特征在于通过构建高产半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白的毕赤酵母表达系统来实现酶在胞外高效分泌。具体步骤如下：1)密码子优化：本专利技术利用软件Gene Designer基于毕赤酵母密码子偏好性，实现半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白蛋白基因的优化。2)表达载体构建：以质粒pPIC9K和pPICZαA作为载体，将优化后的半纤维素酶或纤维素酶基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoR I，3’端酶切位点为Not I，构建含有半纤维素酶、纤维素...

【技术特征摘要】
1.一种利用双质粒重组毕赤酵母表达系统提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白产量的方法，其特征在于通过构建高产半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白的毕赤酵母表达系统来实现酶在胞外高效分泌。具体步骤如下：1)密码子优化：本发明利用软件GeneDesigner基于毕赤酵母密码子偏好性，实现半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白蛋白基因的优化。2)表达载体构建：以质粒pPIC9K和pPICZαA作为载体，将优化后的半纤维素酶或纤维素酶基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRI，3’端酶切位点为NotI，构建含有半纤维素酶、纤维素酶或辅助酶基因的重组表达载体。3)获取重组菌株：利用两步电击转化法，以SacI作为pPIC9K重组表达载体(含有半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶蛋白基因)线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转化转入毕赤酵母，筛选高酶活菌株。随后，将SacI线性化的pPICZαA重组表达载体(含有半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶蛋白基因)表达载体电击转化入上述筛选到的重组毕赤酵母中，获得更高产酶能力的双质粒菌株。4)优化诱导产酶条件：以BMMY作为产酶培养基，优化培养基初始pH值、诱导剂(甲醇)量、培养温度和摇床转数(溶氧)，实现半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶稳定高效产...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙付保，张云博，张震宇，白仁惠，杨慧敏，王春迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32