一种pPIC9‑ompA‑Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母表达系统中的诱导表达及其应用技术方案
A pPIC9 ompA Fc recombinant plasmid, construction method, and its application in inducing the expression of Pichia pastoris expression system.
The invention provides a construction of a pPIC9 ompA Fc recombinant plasmid, expression method, and application thereof, which belongs to the technical field of gene engineering, with b.avium DNA and mRNA in chicken spleen as a template synthesis of cDNA as template, ompA linker gene and chicken IgY Fc linker gene were obtained by PCR, and then the two PCR products were SOE PCR ompA linker Fc fusion gene, the fusion gene is connected to the PMD18 plasmid T, transformed connection sequencing of recombinant plasmid, double enzyme digestion and connected to the expression vector pPIC9, the products were transformed by the bacteria, then identified positive transformants obtained. PPIC9 ompA Fc fusion plasmid. The present invention successfully cloned b.avium ompA and chicken IgY Fc, and two kinds of gene fusion expression plasmid to achieve the recombinant plasmid, Pichia pastoris, low cost, enhanced the activity of fusion protein.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒、构建方法、在毕赤酵母中的表达及其应用。
技术介绍
禽波氏杆菌(Bordetella avium,B.avium)引起的禽波氏杆菌病，是一种高度接触性，可水平传播也可垂直传播的，以孵化率降低，死雏率升高和成年鸡上呼吸道症状为特征的疾病。禽波氏杆菌共表达5种外膜蛋白，分别为95、92、91.5、84和51kDa大小。在6株禽波氏杆菌中均发现了相似分子量的铁反应性外膜蛋白(FeRPs)，其中的5种至少为多数禽波氏杆菌外膜中所共有的组分(Terry D et al 1998)。近年来，由禽波氏杆菌所引起的家禽疫病在世界范围内常有发生，流行病学调查显示禽波氏杆菌已广泛存在并且在不同地区的感染率为10％-45％之间(周东顺等，2004)，常与大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等共同引发细菌多重感染，或者继发于鸡传染性贫血病毒，禽网状内皮增殖症病毒(Jackwood M W et al，1985)，鸡白血病病毒等免疫抑制性病毒，其耐药性不断增加，给养禽业造成的损失越来越大。胡晓娜等(2007)研究发现，禽波氏杆菌OMP能够刺激机体产生高滴度的抗体水平，足以保护禽免受强毒侵袭；刘冠华等人提取了禽波氏杆菌的总外膜蛋白，免疫BALB/c小鼠，制备的单克隆抗体，用于检测禽波氏杆菌，发现与其他分子生物学，病原学和血清学检测方法重合率接近100％。Gentry-Weeks Claudia R(1998)等人研究发现禽波氏杆菌的ompA相比其他的omp结构，能够刺激机体产生高水平的抗体，可以作为一种保护...
【技术保护点】
一种pPIC9‑ompA‑Fc重组质粒，其特征在于，根据NCBI中查找的禽波氏杆菌标准株ompA，（如SEQ ID NO：1）和鸡IgY Fc，（如SEQ ID NO：2）的核苷酸序列，设计两对特异性引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点和linker连接子，（如SEQ ID NO：4 5 6 7所示，）通过PCR方式分别扩增出两个基因ompA‑linker和IgY Fc‑linker，并通过SOE‑PCR方法将两个基因融合成ompA‑Fc基因片段，（如SEQ ID NO：3 所示，）以含氨苄青霉素筛选标签的pPIC9 表达质粒为载体，在pPIC9的限制性酶切位点Not I和Xhol I之间插入ompA‑Fc基因全长，构建成一种含ompA‑Fc基因全长和氨苄青霉素筛选标签的pPIC9重组质粒，即pPIC9‑ompA‑Fc 重组质粒。
【技术特征摘要】
1.一种pPIC9-ompA-Fc重组质粒，其特征在于，根据NCBI中查找的禽波氏杆菌标准株ompA，（如SEQ ID NO：1）和鸡IgY Fc，（如SEQ ID NO：2）的核苷酸序列，设计两对特异性引物，并在引物中插入限制性内切酶酶切位点和linker连接子，（如SEQ ID NO：4 5 6 7所示，）通过PCR方式分别扩增出两个基因ompA-linker和IgY Fc-linker，并通过SOE-PCR方法将两个基因融合成ompA-Fc基因片段，（如SEQ ID NO：3 所示，）以含氨苄青霉素筛选标签的pPIC9 表达质粒为载体，在pPIC9的限制性酶切位点Not I和Xhol I之间插入ompA-Fc基因全长，构建成一种含ompA-Fc基因全长和氨苄青霉素筛选标签的pPIC9重组质粒，即pPIC9-ompA-Fc 重组质粒。2.根据权利要求1所述的pPIC9-ompA-Fc 重组质粒，其特征在于，所述一对引物，以禽波氏杆菌全基因组DNA为模板PCR扩增ompA基因，得到ompA-linker；另一对引物以鸡脾脏cDNA为模板进行IgY Fc段序列PCR 扩增反应得到IgY Fc-linker；以这两种PCR产物为模板通过SOE-PCR扩增融合基因ompA-Fc。3.根据权利要求1或2所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒，其特征在于，所述禽波氏杆菌 ompA基因序列和所述鸡IgY-Fc基因序列分别加入的linker连接子为柔性linker肽段连接子，所述连接子为10个氨基酸，所述连接子具有氨基酸序列自选的为：GGGGSGGGGS。4.一种根据权利要求1-3任一项所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，其特征在于，构建方法步骤如下：1) 从NCBI中查找禽波氏杆菌标准株ompA（如SEQ ID NO：1）和鸡IgY Fc（如SEQ ID NO：2）核苷酸序列，与pPIC9质粒谱图信息相比较，确定引物设计中引入pPIC9质粒上携带的酶切位点为Xho I和Not I；2）pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建：①禽波氏杆菌ompA-linker的PCR扩增以禽波氏杆菌 P5 株DNA为模板， 利用含有linker连接子的引物进行 PCR扩增，得到ompA-linker；鸡IgY Fc-linker的PCR扩增提取成年鸡脾脏RNA，反转录得到cDNA，利用含有linker连接子的引物进行PCR扩增，得到鸡IgY Fc-linker；分别胶回收ompA-linker和Fc-linker基因，以禽波氏杆菌ompA上游引物 Primer1 (如SEQ ID NO：4 所示) 和鸡IgY Fc下游引物Primer4 (如SEQ ID NO：7 所示) 特异性引物进行SOE-PCR扩增得到ompA-Fc融合基因（如SEQ ID NO：3所示）;②将胶回收得到的融合基因ompA-Fc，经过16℃过夜连接，经转化，质粒酶切及测序得到PMD18-T-ompA-Fc重组质粒;③将双酶切PMD18-T-ompA-Fc重组质粒得到的ompA-Fc融合基因胶回收，与用相同的限制性内切酶酶切的pPIC9表达质粒于16℃过夜连接，经转化，酶切及测序得到正确的重组表达质粒，并命名为：pPIC9-ompA-Fc。5.根据权利要求4所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，其特征在于: 禽波氏杆菌ompA的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3 μL、10×buffer (含有Mg2+) 2.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、dNTP 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、高保真Taq酶0.2 μL， 总体积为25 μL； 其PCR反应条件为：95.0℃，5 min的预变性， 30个循环的变性、退火和延伸， 其中，变性条件为95.0℃，30s， 退火条件为56.0℃， 45s，延伸I条件为72.0℃， 90s；延伸II 条件为72.0℃，10 min。6.根据权利要求4所述的pPIC9-ompA-Fc重组质粒的构建方法，其特征在于，鸡IgY Fc的PCR扩增的体系为：ddH2O 17.3 μL、10×buffer(含有Mg2+)2.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、dNTP 2.0 μL、鸡脾脏cDNA 1.0 μL、高保真Taq酶0.2 μL，...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱瑞良，魏凯，胡莉萍，董雯雯，黄河，刘丽萍，李鑫，于翠莲，张浩，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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