人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物技术

本发明专利技术公开了人工半合成染色体整合方法及含有完整合成染色体的微生物，该方法包括：(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点；(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。该方法能够有效地用于两条人工半合成染色体的整合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物。
技术介绍
酿酒酵母是一种重要的工业微生物，带有人工合成染色体的酿酒酵母菌株比野生菌株更具优势，在科学研究和工业生产上都具有重要意义。酿酒酵母共16条染色体，总长度约为12mbp；其中最长的为IV号染色体，长度约为1.5mbp。Sc2.0项目是由美国纽约大学科学家JefD.Beoke等人发起的旨在人工设计并从头合成酿酒酵母全基因组的国际合作项目。2011年JefD.Beoke等人在Nature杂志上发表文章提出该项目计划，并合成了酿酒酵母IX号染色体右臂和VI号染色体左臂，进行了一系列方法测试，阐述了该计划的可行性。2014年，JefD.Beoke实验室终于完成了酿酒酵母III号染色体的人工合成工作，合成染色体总长度约为273kbp。目前酵母染色体合成采用的是分段合成、从左到右逐段替换掉野生染色体序列的方式，每次替换的DNA序列长度约为30kbp(称为一个megachunk)。这种合成策略虽然可行，但是也带有一些明显的缺陷：比如单一方向合成，用时较长；如果前一段的合成序列替换失败，后续的所有合成片段都无法进行替换，风险较大等。总之，目前的染色体合成方法仍有待改进。并且，在人工染色体合成中，染色体的整合是关键。然而，目前尚没有合适的染色体整合方法。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前染色体合成采用的是分段合成、从左到右逐段替换掉野生染色体序列的方式，如果能够将一条染色体分成2段或2段以上，分别进行替换，然后再将半合成的染色体整合成一条全合成的染色体，将大大提高酵母染色体合成的效率。染色体的长度越长，这种策略的优势就越明显。在这个策略中，染色体整合是关键，所以目前急需一种可行且高效的合成染色体整合方法。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种可行且高效的人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种人工半合成染色体的整合方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点，其中，所述预定酶切位点在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体上的位置被配置为适于在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间基于所述整合同源区发生同源重组；(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。专利技术人惊奇地发现，利用本专利技术的方法能够有效地将两条人工半合成染色体进行整合，并且步骤简单，需时短，可重复性好，结果准确可靠。根据本专利技术的实施例，所述整合同源区为的长度大于1k。根据本专利技术的实施例，所述预定酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位点的至少一种。从而，能够特异性识别所述预定酶切位点的预定酶可以为I-SceI酶、I-CeuI酶、PI-PspI酶或PI-SceI酶。根据本专利技术的一些具体示例，所述预定酶切位点为I-SceI酶切位点，所述预定酶为I-SceI。根据本专利技术的实施例，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带第一抗性标记，所述第一抗性标记用于筛选在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。根据本专利技术的实施例，所述第一抗性标记为选自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一种。根据本专利技术的另一些实施例，所述第一抗性标记为URA3。由此，在表达预定酶的菌株中进行酶切处理之后，通过FOA负筛选技术，可以筛选得到发生了酶切的菌株(如Ura-菌株)，从而可以进一步提高整合效率。根据本专利技术的实施例，所述第二人工半合成染色体携带第二抗性标记，所述第二抗性标记用于筛选具有所述完整合成染色体的孢子。根据本专利技术的实施例，所述第二抗性标记为选自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一种。根据本专利技术的另一些实施例，所述第二抗性标记为LEU2抗性标记。通过引入LEU2筛选标记，可以在进行同源重组后，通过影印SC-Leu培养基平板，直接筛选得到Leu-的孢子。根据本专利技术的实施例，步骤(2)进一步包括：a.将携带第一人工半合成染色体的菌株和携带第二人工半合成染色体的菌株进行杂交，并挑选单克隆；以及b.向所述单克隆导入所述预定酶的表达质粒，并诱导所述预定酶的表达，进行酶切处理，以便获得在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。根据本专利技术的实施例，步骤(2)进一步包括：c.将经过酶切处理的菌液诱导产孢，并筛选孢子，即得完整合成染色体。根据本专利技术的实施例，通过醋酸锂法导入所述预定酶的表达质粒。由此，效率高，整合位置准确，成本低廉。根据本专利技术的实施例，利用半乳糖培养基诱导所述预定酶表达，进行酶切处理。由此，该预定酶表达率高，诱导效果好，有利于酶切处理的进行。根据本专利技术的实施例，所述染色体为真核细胞，优选酵母细胞，更优选酿酒酵母细胞的染色体。也即本专利技术的方法适用于真核细胞，优选适用于酵母细胞，尤其适用于酿酒酵母细胞的合成染色体的整合。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种含有完整合成染色体的微生物。根据本专利技术的实施例，所述完整合成染色体是通过前面所述的人工半合成染色体的整合方法，由人工半合成染色体整合获得的。根据本专利技术的实施例，本专利技术的含有完整合成染色体的微生物，染色体完整、准确。需要说明的是，根据本专利技术的实施例，本专利技术的方法具有下列优点的至少之一：1、本专利技术在实现合成染色体整合的同时，通过引入I-SceI等预定酶切位点并将半合成染色体切成2段或多段，迫使合成染色体发生同源重组，用以提高整合效率；2、通过FOA负筛选技术，可以筛选得到发生了酶切的菌株(如：Ura-菌株)，用以进一步提高整合效率；3、通过引入LEU2等第二抗性标记，可以在随机孢子法筛选孢子步骤中，通过影印第二抗性标记培养基(如SC-Leu)平板，直接筛选得到孢子，用以在提高筛选效率的同时，还使得操作更简单，成本更低，避免了昂贵、操作复杂的四分体显微镜的使用。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术一个实施例，本专利技术的人工半合成染色体的整合方法的原理示意图；图2显示了实施例1中，抗性基因PCR产物及抗性插入转化子鉴定结果；图3显示了实施例1中，合成染色体整合PCR筛选结果；图4显示了实施例1中，合成染色体整合PCR鉴定结果；以及图5-图8分别显示了根据本专利技术一个实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工半合成染色体的整合方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点，其中，所述预定酶切位点在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体上的位置被配置为适于在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间基于所述整合同源区发生同源重组；（2）将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一种人工半合成染色体的整合方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点，其中，所述预定酶切位点在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体上的位置被配置为适于在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间基于所述整合同源区发生同源重组；（2）将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述整合同源区为的长度大于1k。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位点的至少一种，优选I-SceI酶切位点。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带第一抗性标记，所述第一抗性标记用于筛选在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一抗性标记为选自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泰，沈玥，王云，高峰，陈世宏，徐讯，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44