一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法技术方案

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法。所述筛选毕赤酵母启动子的系统包括毕赤酵母菌株和质粒载体，所述的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C‑末端ω肽；所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶N‑末端α肽的核苷酸序列；所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID NO：5。本发明专利技术的有益效果如下：本发明专利技术筛选毕赤酵母启动子的系统在培养平板通过筛查蓝色毕赤酵母菌落就可以很方便的筛选到启动子序列。由于采用平板上直接观察颜色的方法进行筛选，因此，该方法除简便外，还非常高效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法。
技术介绍
巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统由于其具有高表达、低成本、遗传操作简单、表达外源蛋白能进行有限的加工修饰等优点，现已经成为重要的外源蛋白表达系统，特别是在表达真核生物蛋白上显示出了极其诱人的应用前景。外源基因在毕赤酵母中表达首先需要启动子驱动基因的转录。目前在毕赤酵母中广泛使用的驱动外源基因表达的启动子为AOX1和GAP启动子。如要在毕赤酵母中同时表达多个外源蛋白，显然可供选择的启动子数很少。目前研究已涉及将宿主细胞作为微工厂生产有应用价值的代谢产物，这要求将整个代谢途径中的所有酶都在宿主细胞中表达，因此需要多个不同的启动子来驱动不同基因的表达。就表达一种蛋白而言，AOX1和GAP启动子也各自有其缺点：GAP启动子为组成型启动子，不利于表达对毕赤酵母细胞有毒害的蛋白；AOX1启动子为诱导型启动子，但其诱导剂为甲醇。在生产外源蛋白时如有甲醇残留，将会对人体产生毒害。另外，甲醇为易燃易爆物品，对生产也有一定的安全隐患。因此，急需建立一种有效的方法分离和鉴定更多的毕赤酵母启动子，以期使外源基因在毕赤酵母中表达选择启动子时具有更多的灵活性，并且可以使毕赤酵母同时利用不同的启动子表达多个外源基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供共一种筛选毕赤酵母启动子的系统和方法。本专利技术提供的技术方案为：提供一种筛选毕赤酵母启动子的系统，包括毕赤酵母菌株和质粒载体，所述的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C-末端ω肽，所述的β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列为SEQ ID NO：1；所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷酶N-末端α肽序列为SEQ ID NO：3；所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID NO：5，所述Linker DNA序列连接在编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列的5′端。优选的，上述的筛选毕赤酵母启动子的系统中，编码所述β半乳糖苷酶C-末端ω肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。优选的，上述的筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，编码所述的β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。本专利技术提供的另一技术方案为：提供一种利用上述筛选毕赤酵母启动子的系统筛选毕赤酵母启动子的方法，将待筛选毕赤酵母基因组DNA和所述质粒载体进行酶切后连接，所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行培养，提取培养后菌体的质粒，将所述质粒导入所述毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株进行培养至菌落出现，若出现蓝色菌落，则待筛选毕赤酵母基因组DNA含有启动子活性的基因组DNA片段。本专利技术的有益效果如下：1、本专利技术筛选毕赤酵母启动子的系统利用β半乳糖苷酶作为报告蛋白检测毕赤酵母启动子序列，如果有启动子序列存在，将会驱动β半乳糖苷酶基因的表达。β半乳糖苷酶分解无色底物分子5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)产生不溶性的蓝色不溶产物。在培养平板通过筛查蓝色毕赤酵母菌落就可以很方便的筛选到启动子序列。由于采用平板上直接观察颜色的方法进行筛选，因此，该方法除简便外，还非常高效。2、本专利技术筛选毕赤酵母启动子的系统中用于筛选毕赤酵母启动子的质粒载体只含有编码β半乳糖苷酶N-末端α肽序列。由于编码β半乳糖苷酶N-末端α肽序列较小，筛选启动子的质粒载体可以插入更大的毕赤酵母基因组DNA片段。因此，本专利技术的另一个优点在于适合筛选大片段的毕赤酵母启动子序列。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。本专利技术关键构思在于：本专利技术筛选毕赤酵母启动子的系统利用β半乳糖苷酶作为报告蛋白检测毕赤酵母启动子序列，如果有启动子序列存在，将会驱动β半乳糖苷酶基因的表达。β半乳糖苷酶分解无色底物分子5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)产生不溶性的蓝色不溶产物。在培养平板通过筛查蓝色毕赤酵母菌落就可以很方便的筛选到启动子序列。由于采用平板上直接观察颜色的方法进行筛选，因此，该方法除简便外，还非常高效。本专利技术实施例中用到的材料与方法为：所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。分子克隆中所用到的所有工具酶和DNA纯化试剂盒均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体反应条件和使用方法参考其商品说明书。商品化质粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ、pPICZ A、pGAPZ B，大肠杆菌Top10′和毕赤酵母GS115菌株均购自Invitrogen公司，毕赤酵母具体遗传操作技术参照Invitrogen公司的操作说明进行。实施例11、pGAPZ B-LacZω载体的构建β半乳糖苷酶C-末端ω肽由该酶的143-1019氨基酸组成。所述的β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列为SEQ ID NO：1，编码所述β半乳糖苷酶C-末端ω肽的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。设计合成了扩增编码β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列的PCR引物LacZω-F1和LacZω-R1，以含有LacZ基因的质粒pAd/CMV/V5-GW/lacZ为模板，使用高保真Primer Star DNA polymerase进行扩增。PCR反应条件：95℃初始变性5min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应扩增得到一条2900bp的DNA片段。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒回收该PCR片段。LacZω-F1：5'-CCGGAATTCACCATGAACTCGGCGTTTCATCTGT-3'(SEQ ID NO：6)LacZω-R1：5'-CCGGAATTCTATTTTTGACACCAGACCAACTG-3'(SEQ ID NO：7)用限制性内切酶EcoR I分别酶切载体pGAPZ B和PCR的片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒分别进行回收，并对回收后的DNA片段进行定量。将EcoR I酶切纯化的线性化载体pGAPZ B和PCR产物进行连接。连接产物转化大肠杆菌Top10′感受态细胞，涂含25μg/ml Zeocin抗菌素的低盐LB平板(1％蛋白胨；NaCl 0.5％；0.5％酵母浸提物，1.5％琼脂)，37℃培养12-16h。挑选若干在平板上长出的菌落，用5'AOX1通用引物和LacZω-R1引物进行PCR鉴定，鉴定重组质粒中插入片段和方向。鉴定正确的质粒经进一步测序测定确认没有突变后命名为pGAPZ B-LacZω。2、毕赤酵母菌株Gaz115ω的构建及其功能1)、用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0质粒提取试剂盒提取质粒pGAPZ B-LacZω。用Sal I限制性内切酶酶切质粒pGAPZ B-LacZω，使其线性化。酚/氯仿抽提、乙醇沉淀回收线性化质粒。取5-10μg线性化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，包括毕赤酵母菌株和质粒载体，所述的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C‑末端ω肽，所述的β半乳糖苷酶C‑末端ω肽序列为SEQ ID NO：1；所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶N‑末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷酶N‑末端α肽序列为SEQ ID NO：3；所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID NO：5，所述Linker DNA序列连接在编码β半乳糖苷酶N‑末端α肽的核苷酸序列的5′端。

【技术特征摘要】
1.一种筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在于，包括毕赤酵母菌株和质粒载体，所述的毕赤酵母菌株能表达β半乳糖苷酶C-末端ω肽，所述的β半乳糖苷酶C-末端ω肽序列为SEQ ID NO：1；所述的质粒载体含有编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列，所述β半乳糖苷酶N-末端α肽序列为SEQ ID NO：3；所述质粒载体含有一段用于毕赤酵母基因组DNA插入的Linker DNA序列，其序列为SEQ ID NO：5，所述Linker DNA序列连接在编码β半乳糖苷酶N-末端α肽的核苷酸序列的5′端。2.根据权利要求1所述的筛选毕赤酵母启动子的系统，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄义德，林尧，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35