一种分子改造手段提高酿酒酵母的乙醇耐受性的方法技术

本发明专利技术提供一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，该方法为：建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。本发明专利技术利用小GTP水解酶从调节细胞形态入手进而提高细胞乙醇胁迫耐受响应，采用类似全局转录调控的方法对小GTP水解酶进行随机突变，通过主动干预细胞形态来达到调节细胞乙醇耐受性的目的。通过本发明专利技术方法可有效筛选到乙醇耐受性提高的菌株，构建的载体有普遍适用性，可适用于实验室酵母、工业酵母。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及工业微生物胁迫耐受性领域和分子生物学领域，特别是涉及一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法。
技术介绍
自近几十年爆发的资源危机以来，能源枯竭以及日趋恶化的环境问题，使燃料乙醇作为新型可再生清洁能源备受关注。燃料乙醇是一种代表性的可再生清洁能源，可以缓解我国能源紧张的现状、降低原油进口依赖度，并能大大缓解化石燃料炼制与消费过程中带来的严重环境污染问题，目前燃料乙醇已经实现了大规模工业化生产和应用。人们希望利用廉价的木质纤维素原料最终实现超高浓度(VeryHighGravity，VHG)乙醇发酵，通过超过25％(v/v)的高终点乙醇浓度来大大降低了乙醇精馏能耗和废槽液总量、提高生产效率。但在发酵过程中，随着终产物乙醇浓度的提高，乙醇在一众环境胁迫因子(温度、渗透压、低pH、纤维素原料降解产生的有毒副产物等)中成为最主要的胁迫因素，酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制甚至出现生长停滞和死亡的现象。从过程工程控制角度进行的工艺优化只能部分缓解这种胁迫因素，不能完全弥补酵母菌本身性能下降引发的发酵效率的降低问题。因此，揭示酵母细胞复杂的乙醇胁迫响应机制、有效的筛选或构建具有高耐受性高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。组学的深入分析揭示应对乙醇胁迫细胞在整体的转录/翻译水平发生了调整，表达水平发生变化的基因数量依据不同的乙醇作用方式可达上百甚至上千，因此分子水平上的耐性改造策略已采用全局性、非靶向性的方法来代替传统单基因操作，如基因组改组、全局转录调控等；生理生化水平的研究集中在乙醇胁迫响应下酵母细胞膜和细胞壁的组分改变、防止蛋白变性的大分子物质的积累、更活跃的氧化-还原酶系统等，但对细胞形态和乙醇耐受性关系研究及机理探讨还很鲜见，酵母细胞在乙醇胁迫下出现的\伸长\、\单极出芽\等现象仅被认为是细胞被动承受乙醇胁迫的附属结果，并且认为这种\伸长\使细胞的处境更为不利，活性进一步降低。但是，已有很多实例表明酵母细胞受到环境的刺激、伴随极化状态改变而出现的细胞形态变化其目的是更快更好的适应环境，如假丝酵母只有在假丝型生长状态下才具有致病性，酿酒酵母在限氮固体培养基上出现的丝状生长现象使其扩展生存空间获取营养。因此猜测酿酒酵母乙醇胁迫下形态的改变可能与细胞主动的乙醇响应存在关系，解决这一问题的关键是找到细胞形态与胁迫耐受性之间的媒介与桥梁，小分子量GTP水解酶家族引起了我们的关注。小分子量GTP酶的功能为结合并水解鸟苷酸，当其活性部位被GTP占据后发生构象变化，特定部位可介导自身与下游靶点相互作用。在酿酒酵母的研究中已证明小GTP酶的活性与多种胁迫响应有关，如细胞壁损伤修复、多效药物响应(pleiotropicdrugresponse，PDR)、离子胁迫响应、饥饿及耐热性、渗透压胁迫、活性氧(ROS)产生与消除途径等，直接或间接影响众多基因的转录表达，如与多效胁迫响应相关的雷帕霉素靶TOR复合物I(TORC1)依赖的信号级联过程、HOGMAPkinase途径、Pkc1依赖的细胞壁完整CWI途径等。但小GTP酶与乙醇耐受性直接或间接相关的报导还较少见。
技术实现思路
为弥补现有技术的不足，本专利技术提供了一种以RhoGTPase为中心靶点改造菌种的方法用于提高酿酒酵母乙醇胁迫耐受性。本专利技术的技术方案如下：一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。优选地，所述RHO1基因的突变序列文库由易错PCR获得。优选地，突变序列文库靶基因为RhoGTPase中的RHO1基因。优选地，用于酿酒酵母转化的载体以pRS316为骨架、由对应宿主的PGK1启动子调节插入片段表达。优选地，以PGK-F/R为引物PCR扩增启动子片段pRS316载体。更为具体地，一种提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，包括以下步骤：S1.基因组选取；取酿酒酵母种子接种于YPD培养基30℃过夜培养后，以标准方法提取酵母基因组。S2.以PGK-F/R为引物PCR扩增对应宿主PGK1启动子片段，以BamHI和EcoRI双酶切、回收后，连入经BamHI和EcoRI双酶切线性化的pRS316载体，转化E.coliDH5α，挑选阳性克隆并提取质粒，同样双切验证片段正确后，命名该载体为pRS316-PGK01；S3.以基因组为模板，用引物对RHO-F/R利用易错PCR扩增RHO1基因，克隆得到的片段纯化后与载体pRS316-PGK01分别进行EcoRI、KpnI双酶切，随后进行连接反应，进行转化大肠杆菌E.coliDH5α，挑选阳性克隆制成混菌，提取质粒，即为突变序列的载体文库。S4.将突变序列的载体文库的突变载体转入酿酒酵母，以G418(终浓度100ug/mL)为筛选药物，涂布于含5-12％(v/v)乙醇的平板上，筛选得到耐受性高的菌株。优选的，所述步骤S4中，乙醇平板培养条件具体为：30℃培养48h，挑选可以正常生长的菌落，进行耐受性评价，筛选得耐受性高的菌株。上述方法可适用于工业酿酒酵母或实验室模式菌株。本专利技术利用小GTP水解酶从调节细胞形态入手进而提高细胞乙醇胁迫耐受响应，采用类似全局转录调控的方法对小GTP水解酶进行随机突变，通过主动干预细胞形态来达到调节细胞乙醇耐受性的目的。这一新的耐受性调节方式的引入对乙醇耐性机理研究与提高燃料乙醇生产效率都有重要的意义，并可以为适应性进化研究提供参考。通过本专利技术方法可有效筛选到乙醇耐受性提高的菌株，构建的载体有普遍适用性，可适用于实验室酵母、工业酵母。附图说明图1为本专利技术实施例1启动子电泳图；图2为本专利技术实施例1测序发现的套峰；图3为本专利技术实施例1的pRS315-PGK-RHO01双酶切验证电泳图；图4为本专利技术实施例1乙醇耐受性考察结果图；其中，A为YPD平板；B为含5％(v/v)无水乙醇的YPD平板；图5为本专利技术实施例2突变株乙醇耐受性验证结果图；其中，A为YPD平板，B为含12％(v/v)乙醇的YPD平板。具体实施方式下面以具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但本专利技术不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。(1)菌株：实验室模式酿酒酵母Sc288c、工业酿酒酵母Sc4126；大肠杆菌E.coliDH5α。(2)载体骨架：pRS316。(3)培养基：YPD培养基：葡萄糖2.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母浸粉0.5wt％，自来水溶解，固体培养基加琼脂2wt％LB液体培养基：蛋白胨1wt％，酵母浸出粉0.5wt％，NaCl1wt％，去离子水配置，pH7.0-7.2，固体培养基加2wt％的琼脂。(4)引物：实施例1提高实验室模式菌株S288c乙醇胁迫耐受性：(1)基因组提取：取处于对数生长期后期到稳定期前期的实验室酵母Sc288c过夜培养物，3000r/min离心5min，弃上清，用3ml无菌水洗细胞，3000r/min离心5min，用500ul裂解缓冲液(0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，50mmol/LEDTA，1％SDS)再次悬浮，加入干净酸洗玻璃珠(约1.5mi离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，建立RHO1基因的突变序列文库，导入酿酒酵母，通过添加乙醇的平板筛选方法获得耐受性提高的菌株。2.根据权利要求1所述的一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，所述RHO1基因的突变序列文库由易错PCR获得。3.根据权利要求1所述的一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，突变序列文库靶基因为RhoGTPase中的RHO1基因。4.根据权利要求1所述的一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，用于酿酒酵母转化的载体以pRS316为骨架、由对应宿主的PGK1启动子调节插入片段表达。5.根据权利要求1所述的一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，以PGK-F/R为引物PCR扩增启动子片段pRS316载体。6.根据权利要求1所述的一种分子改造手段提高酿酒酵母乙醇耐受性的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1.基因组选取；S2.以PGK-F/R为引物PCR扩增对应宿主PGK1启动子片段，以BamHI和EcoRI双酶切、回收后，连入经BamHI和EcoRI双酶切线性化的pRS316载体，转化E.coliDH5α构建载体pRS316-PGK01；S3.以基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，王亮，韦光绪，余雅娴，代青川，宋海锋，刘欢，杨东春，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21