本发明专利技术公开了细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母，构建为：(1)从毕赤酵母基因组中克隆出锚定蛋白基因；化学合成疏水蛋白基因和PETase基因；(2)锚定蛋白基因和PETase基因连接得融合序列1；锚定蛋白基因和疏水蛋白基因连接得融合序列2；(3)将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体2；(4)融合表达载体1、2转入表达宿主毕赤酵母中，得到本发明专利技术的重组毕赤酵母。本发明专利技术使酶固着定位于细胞表面。与游离酶相比具有稳定性高、易回收、反复使用、成本低，疏水蛋白与PETase在毕赤酵母中共展示增强重组毕赤酵母的稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶的基因工程
，涉及一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母及构建方法及应用。
技术介绍
白色污染是全球所有城市都存在的一种环境污染，主要是指人们在日常生活中随意丢弃的塑料垃圾对环境造成的破坏，包括常见的塑料杯、一次性饭盒、塑料袋等。这些塑料类产品以石油为原料，采用聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等高分子化合物制成，难以进行降解，再加上生活中的塑料包装大多呈白色，被人们使用并随意丢弃后会呈现出丑、脏、乱、杂等无秩序、不协调的特点，干扰和刺激人们的视觉，让人产生厌烦心理，所以被称为白色污染。而白色污染物的很大一部分是PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前，世界上PET的年产量达到了2700多万吨，虽然PET不会直接对环境造成危害，但其废弃物对大气和微生物的抵抗性很强，在自然环境中的存在周期为16-48年，而且随着PET产业的快速发展，其废弃物的数量极其巨大，从环境行为和生态效应考虑，PET废弃物已成为全球性的环境污染有机物。目前降解PET的方法主要有化学降解和生物降解两大类，在实际应用中PET的化学分解法主要有水解法和醇解法，此外还有氨解、胺解和热解等。但是这些方法通常成本较高、效率较低并且不环保，避免不了降解PET后给环境带来二次污染；而生物降解方法相对化学降解工艺更简单、更节能环保、且不会造成二次污染。因此生物降解将是从根本上解决废弃PET污染的最好方法。聚对苯二甲酸乙二醇酯分解酶(PETase)是目前唯一一个在细菌中发现的能降解PET的酶，分子量约为32KD，能将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸或对苯二甲酸，其最大的优势是，与其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比，其在低温段(20～40℃)的酶活显著高于其他酶，这意味着在实际应用中较容易达到适宜的反应条件，工业应用前景较好。疏水蛋白HGF1/HFB1是一种丝状真菌产生的小分子量(12KD左右)蛋白质，最主要的功能之一就是能够自主装在任何亲/疏水界面形成一层两亲性的膜来改变界面的性质，并且该蛋白具较强耐高温、耐酸碱和较低免疫原性等的特点。但目前尚未有细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组菌的报道。参考文献：[1]ShosukeYoshida,KazumiHiraga,ToshihikoTakehana,IkuoTaniguchi,HironaoYamaji,YasuhitoMaeda,KiyotsunaToyohara,KenjiMiyamoto,YoshiharuKimura,KoheiOda.Abacteriumthatdegradesandassimilatespoly(ethyleneterephthalate)[J].science，2016(351)：1196-1199.[2]LiXiuhua,WangZiying.ResearchProgressonDegradationofPET[J].塑料科技，2011(4):110-114.
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。本专利技术的第二个目的是提供一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建。本专利技术的第三个目的是提供一种细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的应用。本专利技术的技术方案概述如下：细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建，包括如下步骤：(1)从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因；化学合成疏水蛋白基因和如SEQIDNO.1所示的PETase基因；(2)利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQIDNO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和疏水蛋白基因连接得到融合序列2；(3)将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体2；(4)将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。锚定蛋白基因优选：SEQIDNo.3所示的GCW51、SEQIDNo.4所示的GCW61或SEQIDNo.8所示的GCW21。疏水蛋白基因优选SEQIDNO.2所示的HGF1基因、SEQIDNO.9所示的HFB1基因、SEQIDNO.10所示的SC3基因或SEQIDNO.11所示的HFB2基因。毕赤酵母表达载体优选：ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC。上述构建方法构建的细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。上述细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母在全细胞催化分解PET的用途。本专利技术的有益效果：本专利技术应用整合载体进行表达，避免了选择压力且载体不容易丢失。当PETase在细胞表面表达时，相当于做了酶的固定化，将其固着定位于细胞表面。经固定化后的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，避免了蛋白纯化的繁琐。而利用疏水蛋白与PETase在毕赤酵母中进行共展示，由于疏水蛋白具有双亲性，会自发以亲水面与酵母细胞表面结合，疏水面朝外，增强重组毕赤酵母的稳定性。附图说明图1为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HGF1/P.pastorisPETase-GCW51-HFB1的WesternBlot图；其中：图1A为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HGF1的WesternBlot图；图1B为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HFB1的WesternBlot图。图2为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HGF1/P.pastorisPETase-GCW51-HFB1的相对酶活。图3为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HGF1/P.pastorisPETase-GCW51-HFB1的免疫荧光检测结果图；其中：图3-1为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HGF1的免疫荧光检测结果图；图3-2为重组毕赤酵母P.pastorisPETase-GCW51-HFB1的免疫荧光检测结果图；具体实施方案下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。锚定蛋白GCW21(NCBIReferenceSequence:XM_002491407)；锚定蛋白GCW51(NCBIReferenceSequence:XP_002493782)；锚定蛋白GCW61(NCBIReferenceSequence:XP_002494322)序列。毕赤酵母GS115(pichiapastorisGS115)市售。也可以用其它的毕赤酵母应用于本专利技术。ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC，均为市售。大肠杆菌(E.coli)DH5α，市售。实施例1细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母(P.pastorisPETase-GCW51-HGF1)的制备及应用：一、从毕赤酵母GS115基因组中克隆出如SEQIDNo.3所示的GCW51锚定蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建，其特征包括如下步骤：(1)从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因；化学合成疏水蛋白基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因；(2)利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和疏水蛋白基因连接得到融合序列2；(3)将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体2；(4)将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。
【技术特征摘要】
1.细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建，其特征包括如下步骤：(1)从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因；化学合成疏水蛋白基因和如SEQIDNO.1所示的PETase基因；(2)利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和SEQIDNO.1的核苷酸序列连接得到融合序列1；利用PCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和疏水蛋白基因连接得到融合序列2；(3)将融合序列1连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体1；将融合序列2连接到毕赤酵母表达载体上，得到融合表达载体2；(4)将融合表达载体1和融合表达载体2转入表达宿主毕赤酵母中，得到细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母。2.根据权利要求1所述的细胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重组毕赤酵母的构建，其特征所述锚定蛋白基因为SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：王泽方，杨海涛，陈卓芝，程莹莹，王雪，童善惟，侯宇佳，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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