多肽表达系统技术方案

本发明专利技术涉及多肽表达系统和使用该多肽表达系统的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表本申请包含已经以ASCII形式以电子方式提交的序列表，在此通过全文引用插入。所说的ASCII副本是在2015年6月25日生成的,被命名为P05833-WO_SL.txt并且大小为24,421个字节。专利
本专利技术涉及用于模块化表达和生产多肽的多肽表达系统。
技术介绍
重组多肽有时是以用于功能性或纯化目的的单个结构域或标志物的融合体形式被表达的。传统上使用重组DNA方法来连接编码每个模块的序列,对于每一种组合，需要不同的构建体。这给涉及由以不同组合加入的复现模块组成的大的蛋白质集合表达的技术提出了挑战,因为构建体的数目作为所用的模块数目的函数以几何方式增加。尽管用于亚克隆的高通量系统能够平行地处理许许多多的插入片段,但是它们通常是资源密集的并且产生大量的构建体，在初始表征步骤以后，这些构建体最终不是必需的。因此,在关于发展允许模块化表达和生产重组多肽的多肽表达系统的领域，存在着未满足的需要。专利技术概述本专利技术涉及用于模块化表达和生产多肽的多肽表达系统。在一个方面中,本专利技术的特征是包含第一核酸分子和第二核酸分子的多肽表达系统,其中(a)所述的第一核酸分子包括包含下列组件的第一表达盒:(i)第一真核启动子(P1Euk1)、(ii)编码第一多肽的序列(PES11)、(iii)第一5’剪接位点(5’ss11)和(iv)杂交序列(HS1),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成P1Euk1-PES11-5’ss11-HS1；并且(b)所述的第二核酸分子包含下列组件:(i)真核启动子(P2Euk)、(ii)能够与HS1杂交的杂交序列(HS2)、(iii)3’剪接位点(3’ss2)、(iv)编码多肽的序列(PES2)和(v)多聚腺苷酸化位点(pA2),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成P2Euk-HS2-3’ss2-PES2-pA2。在一些实施方式中,所述的P1Euk1是巨细胞病毒(CMV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。在一些实施方式中,所述的P1Euk1是巨细胞病毒(CMV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。在一些实施方式中,所述的P2Euk是CMV启动子或SV40启动子。在一些实施方式中,所述的第一表达盒进一步包含编码真核信号序列的第一核酸序列(ESS11),其中所述的ESS11位于所述的P1Euk1和PES11之间。在一些实施方式中,所述的ESS11源自于可变重链(VH)基因。在一些实施方式中,所述的第一表达盒进一步包含包括下列组件的可切除的原核启动子模块(ePPM1):(i)5’剪接位点(5’ss12)、(ii)原核启动子(P1Prok1)和(iii)3’剪接位点(3’ss11),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成5’ss12-P1Prok1-3’ss11,并且其中所述的ePPM1位于所述的P1Euk1和PES11之间。在一些实施方式中,所述的P1Prok1选自由PhoA启动子、Tac启动子、Lac和Tphac启动子组成的组。在一些实施方式中,所述的ePPM1进一步包含编码原核信号序列的第一核酸序列(PSS11)。在一些实施方式中,所述的PSS11源自于热稳定的肠毒素II(stII)基因。在一些实施方式中,所述的多肽表达系统进一步包含位于所述的PSS11和所述的3’ss11之间的多聚嘧啶束(PPT11)。在一些实施方式中,所述的PPT11包含TTCCTTTTTTCTCTTTCC的核酸序列(SEQIDNO:1)。在一些实施方式中,所述的PES11不包含隐蔽的5’剪接位点。在一些实施方式中,所述的HS1是编码外壳蛋白或接头蛋白的全部或一部分的基因。在一些实施方式中,所述的外壳蛋白选自由噬菌体M13、f1或fd的pI、pII、pIII、pIV、pV、pVI、pVII、pVIII、pIX和pX组成的组。在一些实施方式中,所述的外壳蛋白是噬菌体M13的pIII蛋白。在一些实施方式中,所述的pIII片段包括所述的pIII蛋白的氨基酸残基267-421或所述的pIII蛋白的氨基酸残基262-418。在一些实施方式中,所述的接头蛋白是亮氨酸拉链。在一些实施方式中,所述的亮氨酸拉链包含SEQIDNO:4或5的氨基酸序列。在一些实施方式中,所述的第一核酸分子进一步包含第二表达盒，其包含第二真核启动子(P1Euk2)、(ii)编码第二多肽的序列(PES12)和(iii)多聚腺苷酸化位点(pA1),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成P1Euk2-PES12-pA1。在一些实施方式中,所述的P1Euk2是CMV启动子或SV40启动子。在一些实施方式中,所述的第二表达盒进一步包含编码真核信号序列的第二核酸序列(ESS12)。在一些实施方式中,所述的ESS12源自于鼠的结合免疫球蛋白的蛋白(mBiP)基因。在一些实施方式中,所述的ESS12包含ATGAANTTNACNGTNGTNGCNGCNGCNCTNCTNCTNCTNGGN的核酸序列,其中N是A、T、C或G(SEQIDNO:6)。在一些实施方式中,所述的第二表达盒进一步包含可切除的原核启动子模块(ePPM2),其包括下列组件:(i)5’剪接位点(5’ss13)、(ii)原核启动子(P1Prok2)和(iii)3’剪接位点(3’ss12),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成5’ss13-P1Prok2-3’ss12,并且其中所述的ePPM2位于所述的P1Euk2和PES12之间。在一些实施方式中,所述的P1Prok2选自由PhoA启动子、Tac启动子和Lac启动子组成的组。在一些实施方式中,所述的ePPM2进一步包含编码原核信号序列的核酸序列(PSS12)。在一些实施方式中,所述的PSS12源自于热稳定的肠毒素II(stII)基因。在一些实施方式中,所述的多肽表达系统进一步包含位于所述的PSS12和3’ss12之间的多聚嘧啶束(PPT12)。在一些实施方式中,所述的PPT12包含TTCCTTTTTTCTCTTTCC的核酸序列(SEQIDNO:1)。在一些实施方式中,所述的第二表达盒位于所述的第一表达盒的5’端。在一些实施方式中,所述的多肽表达系统进一步包含位于所述的5’ss11和HS1之间的内含子剪接增强子(ISE)(ISE1)。在一些实施方式中,所述的ISE1包括包含三个或更多个连续的鸟嘌呤残基的G-片段。在一些实施方式中,所述的ISE1包括包含九个连续的鸟嘌呤残基的G-片段。在一些实施方式中,所述的多肽表达系统进一步包含位于所述的HS2和3’ss2之间的多聚嘧啶束(PPT2)。在一些实施方式中,所述的PPT2包含TTCCTCTTTCCCTTTCTCTCC的核酸序列(SEQIDNO:7)。在一些实施方式中,所述的多肽表达系统进一步包含位于所述的HS2和3’ss2之间的ISE(ISE2)。在一些实施方式中,所述的ISE2包括包含三个或更多个连续的鸟嘌呤残基的G-片段。在一些实施方式中,所述的ISE2包括包含九个连续的鸟嘌呤残基的G-片段。在一些实施方式中,所述的5’ss11包含GTAAGA的核酸序列(SEQIDNO:8)。在一些实施方式中,经由真核启动子的表达发生在哺乳动物细胞中。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含第一核酸分子和第二核酸分子的多肽表达系统,其中:(a)所述的第一核酸分子包含包括下列组件的第一表达盒:(i)第一真核启动子(P1Euk1)、(ii)编码第一多肽的序列(PES11)、(iii)第一5’剪接位点(5’ss11)和(iv)杂交序列(HS1),其中所述的组件沿着5’‑至‑3’方向彼此有效连接成P1Euk1‑PES11‑5’ss11‑HS1；并且(b)所述的第二核酸分子包含下列组件:(i)真核启动子(P2Euk)、(ii)能够与HS1杂交的杂交序列(HS2)、(iii)3’剪接位点(3’ss2)、(iv)多肽编码序列(PES2)和(v)多聚腺苷酸化位点(pA2),其中所述的组件沿着5’‑至‑3’方向彼此有效连接成P2Euk‑HS2‑3’ss2‑PES2‑pA2。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.03 US 62/020,838;2014.11.17 US 62/080,6981.包含第一核酸分子和第二核酸分子的多肽表达系统,其中:(a)所述的第一核酸分子包含包括下列组件的第一表达盒:(i)第一真核启动子(P1Euk1)、(ii)编码第一多肽的序列(PES11)、(iii)第一5’剪接位点(5’ss11)和(iv)杂交序列(HS1),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成P1Euk1-PES11-5’ss11-HS1；并且(b)所述的第二核酸分子包含下列组件:(i)真核启动子(P2Euk)、(ii)能够与HS1杂交的杂交序列(HS2)、(iii)3’剪接位点(3’ss2)、(iv)多肽编码序列(PES2)和(v)多聚腺苷酸化位点(pA2),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成P2Euk-HS2-3’ss2-PES2-pA2。2.权利要求1所述的多肽表达系统,其中所述的P1Euk1是巨细胞病毒(CMV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。3.权利要求1或2所述的多肽表达系统,其中P2Euk是CMV启动子或SV40启动子。4.权利要求1-3中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的第一表达盒进一步包含编码真核信号序列的第一核酸序列(ESS11),其中所述的ESS11位于P1Euk1和PES11之间。5.权利要求4所述的多肽表达系统,其中所述的ESS11源自于可变重链(VH)基因。6.权利要求1-5中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的第一表达盒进一步包含含有下列组件的可切除的原核启动子模块(ePPM1):(i)5’剪接位点(5’ss12)、(ii)原核启动子(P1Prok1)和(iii)3’剪接位点(3’ss11),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成5’ss12-P1Prok1-3’ss11,并且其中所述的ePPM1位于所述的P1Euk1和PES11之间。7.权利要求6所述的多肽表达系统,其中所述的P1Prok1选自由PhoA启动子、Tac启动子、Lac和Tphac启动子组成的组。8.权利要求6或7所述的多肽表达系统,其中所述的ePPM1进一步包含编码原核信号序列的第一核酸序列(PSS11)。9.权利要求6-8中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的PSS11源自于热稳定的肠毒素II(stII)基因。10.权利要求6-9中任意一项所述的多肽表达系统，其进一步包含位于PSS11和3’ss11之间的多聚嘧啶束(PPT11)。11.权利要求10所述的多肽表达系统,其中所述的PPT11包含TTCCTTTTTTCTCTTTCC的核酸序列(SEQIDNO:1)。12.权利要求1-11中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的PES11不包含隐蔽的5’剪接位点。13.权利要求1-12中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的HS1是编码外壳蛋白或衔接头蛋白的全部或一部分的基因。14.权利要求13所述的多肽表达系统,其中所述的外壳蛋白选自由噬菌体M13、f1或fd的pI、pII、pIII、pIV、pV、pVI、pVII、pVIII、pIX和pX组成的组。15.权利要求14所述的多肽表达系统,其中所述的外壳蛋白是噬菌体M13的pIII蛋白。16.权利要求15所述的多肽表达系统,其中所述的pIII片段包含所述的pIII蛋白的氨基酸残基267-421或所述的pIII蛋白的氨基酸残基262-418。17.权利要求13所述的多肽表达系统,其中所述的衔接头蛋白是亮氨酸拉链。18.权利要求17所述的多肽表达系统,其中所述的亮氨酸拉链包含SEQIDNO:4或5的氨基酸序列。19.权利要求1-18中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的第一核酸分子进一步包含第二表达盒，所述第二表达盒包含第二真核启动子(P1Euk2)、(ii)第二多肽编码序列(PES12)和(iii)多聚腺苷酸化位点(pA1),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成P1Euk2-PES12-pA1。20.权利要求19所述的多肽表达系统,其中所述的P1Euk2是CMV启动子或SV40启动子。21.权利要求19或20所述的多肽表达系统,其中所述的第二表达盒进一步包括编码真核信号序列的核酸序列(ESS12)。22.权利要求21所述的多肽表达系统,其中所述的ESS12来源于鼠的结合免疫球蛋白的蛋白(mBiP)基因。23.权利要求19-22中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的ESS12包含ATGAANTTNACNGTNGTNGCNGCNGCNCTNCTNCTNCTNGGN的核酸序列,其中N是A、T、C或G(SEQIDNO:6)。24.权利要求19-23中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的第二表达盒进一步包含包括下列组件的可切除的原核启动子模块(ePPM2):(i)5’剪接位点(5’ss13)、(ii)原核启动子(P1Prok2)和(iii)3’剪接位点(3’ss12),其中所述的组件沿着5’-至-3’方向彼此有效连接成5’ss13-P1Prok2-3’ss12,并且其中所述的ePPM2位于所述的P1Euk2和PES12之间。25.权利要求24所述的多肽表达系统,其中所述的P1Prok2选自由PhoA启动子、Tac启动子和Lac启动子组成的组。26.权利要求24或25所述的多肽表达系统,其中所述的ePPM2进一步包含编码原核信号序列的核酸序列(PSS12)。27.权利要求24-26中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的PSS12源自于热稳定的肠毒素II(stII)基因。28.权利要求24-27中任意一项所述的多肽表达系统,其进一步包含位于所述的PSS12和3’ss12之间的多聚嘧啶束(PPT12)。29.权利要求28所述的多肽表达系统,其中所述的PPT12包含TTCCTTTTTTCTCTTTCC的核酸序列(SEQIDNO:1)。30.权利要求19-29中任意一项所述的多肽表达系统,其中所述的第二表达盒位于所述的第一表达盒的5’端。31.权利要求1-30中任意一项所述的多肽表达系统,其进一步包含位于所述的5’ss11和HS1之间的内含子剪接增强子(ISE)(ISE1)。32.权利要求31所述的多肽表达系统,其中所述的ISE1包括包...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·霍特策尔，Y·尚，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH