本发明专利技术公开了一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒穿梭表达载体MbBacmid及应用，该Bacmid含有甘蓝夜蛾核型多角体病毒全基因组序列，并含有能在大肠杆菌中复制的基因元件。通过供体质粒pFast-Bac Mbph，外源蛋白基因可快速插入本发明专利技术提供的Bacmid上，在包括Sf9、Tn368、high five 等多种商品化昆虫细胞内进行高效表达。该载体与供体质粒pFast-Bac Mbph+pie1-cath同源重组，可获得提高杀虫速度的重组病毒MbMNPV-ph+ pie1-cath。本发明专利技术提供的表达系统是唯一一个能在多种商品化昆虫细胞中高效表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒穿梭表达载体系统。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的N组甲型杆状病毒Bacmid及应用
本专利技术属于分子生物学和生物工程
，具体涉及一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的II组甲型杆状病毒Bacmid及应用。
技术介绍
杆状病毒是杆状病毒科(Baculoviridae)成员的俗称，根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2012年公布的第9次报告，杆状病毒科分为四个属，分别是甲型杆状病毒属、乙型杆状病毒属、丙型杆状病毒属(Gammabaculovirus，为感染膜翅目昆虫的NPV)和丁型杆状病毒属(Deltabaculovirus，为感染双翅目昆虫的NPV)。根据病毒膜融合蛋白和DNA多聚酶蛋白序列特征及病毒其他特性，甲型杆状病毒属可分为I组和II组。杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒一昆虫(细胞)系统还是十分优良的真核表达系统，己用于外源基因、诊断试剂和疫苗等的研究和生产。甘蓝夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(Mamestra brassicea multiple nucleopolyhedrovirus,MbMNPV)属II组甲型杆状病毒，是一种广谱杆状病毒，可防治32种以上鳞翅目害虫，对重要农业害虫小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾、地老虎、粘虫等都具有较好的控制作用。MbMNPV作为杀虫剂，已获得农药登记，在国内应用面积超过1000万亩。但该病毒的分子生物学基础研究相对滞后，病毒广谱性的分子机制研究较少，病毒也存在杀虫速度较慢的缺陷，其更大范围应用仍受到限制。另外，杆状病毒作为一种真核表达系统，不断提高病毒表达系统的表达量一直是当今生物工程领域的研究热点。对杆状病毒分子生物学的研究，特别是对病毒基因的结构与功能的研究将有助于揭示病毒的复制和广谱侵染机制，为重组病毒杀虫剂和快速、高效表达载体的开发和应用奠定基础。自1983年Smith和Summers首次报道利用I组甲型杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)在草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞中表达人β -干扰素以来，杆状病毒表达载体因其能在昆虫细胞和昆虫幼虫中高效表达外源基因，且在大多数情况下杆状病毒表达系统具有加工和修饰表达产物的能力，如信号肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多数表达产物具有很高的生物活性等优点，使其成为十分重要的真核表达系统。目前应用杆状病毒表达系统己表达了几千种不同来源的外源基因。传统的重组杆状病毒构建需要按以下两步进行:首先，重组杆状病毒必须将外源基因克隆到转移载体质粒的多克隆位点上，通常多克隆位点位于杆状病毒的强启动子控制下。将转移载体同杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞内，经同源重组产生重组病毒，重组率通常在0.1-1%之间。其次，重组杆状病毒需用空斑法鉴定和纯化重组病毒。由于重组病毒的产生率低以及空斑纯化法操作复杂、耗时，往往需数月甚至更长的时间才能构建一个完整的重组病毒。鉴于按传统方法构建杆状病毒表达系统存在上述两个缺陷，Kuckow专利技术了一种快速、有效产生重组杆状病毒的方法，即Bac-to-Bac系统，在7天内就可完成一个重组病毒的构建，并进行外源基因的高效表达。该系统由Bacmid和pFastBac供体质粒两部分组成。Bacmid含有一个低拷贝数的mini_F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个IacZa基因的8.6kb的DNA片段，一个作为细菌转位子插入位点(mini_attTn7)的短片段插入到IacZa基因N-末端，该片段的插入并不改变IacZa基因的阅读框。该Bacmid既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子。pFastBac供体质粒则是由一个min1-Tn7转位因子组成，在mini_Tn7左右臂之间插入一个庆大霉素抗性基因、一个杆状病毒特异强启动子、一个多克隆位点和SV4l3(A)Poly信号序列组成的表达框。在辅助质粒提供的转位酶的作用下，克隆于pFastBac供体质粒多克隆位点的外源基因能转位至Bacmid的mini_attTn7位点上，通过抗生素抗性筛选和蓝白斑筛选鉴定重组Bacmid.随后从E.coli内提取Bacmid DNA转染昆虫细胞进行外源基因表达。该方法具有重组率高、重组病毒筛选方便等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在多种昆虫细胞表达外源蛋白的II组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid(本专利技术或称MbBacmid)。外源蛋白基因可快速插入MbBacmid上，在包括Sf9、Tn368、high five等多种商品化昆虫细胞内进行高效表达，同时可在plO或ph启动子调控下表达回复的多角体蛋白，在ph或pel强启动子的调控下高效表达+eGFP或其他外源基因。重组病毒既可高效表达外源蛋白，又可形成病毒多角体，便于快速分析鉴定。本专利技术提供MbBacmid进行重组病毒研究，获得新重组病毒只需要7_15天，大大提高了利用重组病毒进行病毒基因功能研究的速度，也为构建更为高效快速广谱昆虫病毒杀虫剂提供了便捷的途径。含甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体的菌株已于2015年4月8日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名:大肠杆菌DHlOB(Escherichia coliDH10B)/MbBacmid PhP1，保藏编号CCTCC N0:M2015187。地址:中国武汉武汉大学。用LD培养基培养，培养温度37摄氏度。本专利技术的另一个目的在于提供了一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的II组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术措施:一种能在多种商品化昆虫细胞上进行外源蛋白表达的II组甲型杆状病毒甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid，构建方式包括以下步骤:(I)甘蓝夜蛾核型多角体病毒Bacmid转移载体pMbTV的构建—个含有低拷贝数的细菌DNA复制子(min1-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个IacZa基因、一个作为细菌转位子插入位点(min1-attTn7)的短片段插入到IacZa基因N-末端，形成8.6kb的DNA片段。该片段前面加上甘蓝夜蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因上游约2.3kb片段作为上游同源臂，后面加上多角体蛋白基因下游序列约1.3kb作为下游同源臂，构成转移载体pMbTV。(2)甘蓝夜蛾核型多角体病毒表达载体Mb Bacmid的构建用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子DNA共转染棉铃虫4龄幼虫，提取BVDNA,电转入大肠杆菌DH10B，挑选单菌落，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多角体病毒穿梭表达载体Bacmid。提取不同菌落的Bacmid核酸进行BamH 1、EcoR 1、Hind III和Pst I等内切酶分析，内切酶图谱与野生型病毒较接近的菌落鉴定为甘蓝夜蛾穿梭表达载体MbBacmid-al。用pMbTV和甘蓝夜蛾核型多角体病毒粒子核酸共转染甜菜4龄幼虫，提取BV DNA,电转入大肠杆菌DH10B，挑选单菌落，产生既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整病毒粒子的甘蓝夜蛾核型多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有在多种昆虫细胞表达外源蛋白的Ⅱ组甲型杆状病毒Bacmid的菌株，其特征在于：大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)/MbBacmid PhP10，保藏编号CCTCC NO:M2015187。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张忠信，吴柳柳，类承凤，周吟，程丹凝，刘柳，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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