在昆虫细胞中制备的重组E-选择蛋白制造技术

本发明专利技术包括重组哺乳动物Ｅ－选择蛋白肽，编码所述肽的核酸，具有这些核酸的载体和细胞，及生产所述肽的方法。本发明专利技术进一步包括使用重组哺乳动物Ｅ－选择蛋白肽诱导粘膜对Ｅ－选择蛋白的耐受性以治疗炎症相关的疾病和病变的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在昆虫细胞中制备的重组E-选择蛋白相关申请本申请要求2005年3月10提交的美国临时申请60/660,258的优先权。上述申请的全文并入本文参考。
技术介绍
E-选择蛋白是一种细胞表面糖蛋白细胞粘附分子，其是细胞因子 可诱导的并且只在内皮细胞上发现。E-选择蛋白介导多种白细胞与激 活的内皮的粘附，所述白细胞包括中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性细 胞、天然杀伤细胞(NK)和T细胞亚类。E-选择蛋白在人内皮细胞上 的表达是由应答炎症相关细胞因子IL-1和TNFa以及应答脂多糖 (LPS)通过转录正调节而被诱导的。常规的抗炎干预包括耗尽白细胞的循环库(circulatory pool)、抑制 白细胞功能、和使用免疫抑制药物如环孢菌素A和FK506。然而， 大多数可利用的免疫抑制剂具有全身性副作用，限制了其长期应用。已经显示出自身抗原的粘膜给药在中风和动脉硬化模型中以及 在一些自身免疫性疾病模型如糖尿病、关节炎和实验变态反应性脑脊 髓炎模型中可抑制炎症和疾病活性。通过鼻/口腔多次给予低剂量的 E-选择蛋白诱导对E-选择蛋白的粘膜耐受性。粘膜耐受性是一个公认 的模型，由此通过鼻部滴注或鼻饲抗原而诱导对该特异抗原的免疫学 耐受性。经鼻部给予的抗原遭遇到鼻部相关的淋巴组织，其已经进化 为保护宿主免于入侵的病原体侵犯并获得了防止宿主与吸入的非病 原性蛋白质反应的固有性质。在重复给予低剂量抗原后产生主动耐受 性(active tolerance),伴有调节性T细胞产生。 E选择蛋白表达不是组成型的，基本上限于应答炎症刺激物如 IL-I、 TNF-a或LPS而变得活化的内皮。E-选择蛋白可以在体内局部 炎症部位长期表达，由此E-选择蛋白作为合适的耐受分子指导已经 耐受E-选择蛋白的调节性T细胞到达内皮激活的局部部位。这些已 经用低剂量方案耐受的调节性T细胞在用抗原再刺激时分泌抑制 TH1免疫应答的细胞因子如IL-10和转化生长因子(TGF)bl。尽管这 些T细胞的激活特异于耐受抗原(在这种情况中为E-选择蛋白)，但是 应答激活而分泌的免疫调节性细胞因子具有非特异性作用。因此，无 论所述耐受抗原存在在哪里，局部免疫抑制均将发生。通过使用E-选择蛋白作为耐受剂，可以将免疫抑制靶向于激活 的血管节段(vessel segment)。专利技术概述本专利技术的特征包括重组的哺乳动物E-选择蛋白肽，编码这些肽 的核酸，具有这些核酸的载体和细胞，及生产所述肽的方法。本专利技术 进一步的特征包括使用重组的哺乳动物E-选择蛋白肽诱导对E-选择 蛋白的粘膜耐受性而治疗炎症疾病的方法。本专利技术提供了一系列哺乳动物E-选择蛋白肽。 一种E-选择蛋白 肽基本上由野生型人E-选择蛋白(SEQ ID NO: l)的第20—303位残基 组成。这种肽可具有附着于其的一或多个C末端标记，包括羧基末 端二肽RS。另外，本专利技术包括附着有N末端分泌信号肽的这种肽。 尽管优选人重组肽，但也可以使用其它哺乳动物肽，优选是与SEQ ID NO: 1具有至少60%相同性的由200—400个氨基酸组成的肽。本发 明也涵盖哺乳动物E-选择蛋白肽的混合物和组合。本专利技术的肽的C末端标记包括纯化标记和稳定化标记如c-myc 标记和组氨酸标记。N末端分泌信号肽包括哺乳动物和昆虫细胞衍生 的肽。N末端分泌性信号肽包括AcMNPV gp64 env分泌序列MGWSWIFLFLLSGTASVHS (SEQ ID NO:3)， 信号肽序列 MGWSWIFLFLLSGTAS (SEQ ID NO:4)，以及野生型人信号序列肽 MIASQFLSALTLVLLIKESGA (SEQ ID NO:2)。本专利技术的肽可以在多 种细胞系中生产，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母。本专利技术的特征还在于编码一系列哺乳动物E-选择蛋白肽的核酸 分子。所述核酸分子编码基本上由野生型人E-选择蛋白(SEQIDNO:l) 的第20—303位残基组成的E-选择蛋白肽。编码这种E-选择蛋白肽 的核酸分子可具有附着于其的一或多个C末端标记，包括羧基末端 二肽RS。另外，本专利技术包括编码附着有N末端分泌性信号肽的这种 基本E-选择蛋白肽的核酸分子。尽管优选编码优选地具有200—400 个氨基酸的人重组肽的核酸分子，但是也可以使用编码与SEQ ID NO: 1具有至少60%相同性的其它哺乳动物肽的核酸分子。本专利技术也涵盖 哺乳动物E-选择蛋白肽的混合物和组合。本专利技术的特征还在于编码纯化标记和稳定化标记如c-myc标记 和组氨酸标记的核酸分子。所述核酸分子可以编码N末端分泌性信 号肽，包括哺乳动物和昆虫细胞衍生的肽。所述核酸分子可编码N 末端分泌性信号肽，包括AcMNPV gp64 env分泌序列 MGWSWIFLFLLSGTASVHS (SEQ ID NO: 3)，信号肽序列 MGWSWIFLFLLSGTAS (SEQ ID NO: 4)，以及野生型人信号序列肽 MIASQFLSALTLVLLIKESGA (SEQ ID NO: 2)。所述核酸分子可用于 在多种细胞系中生产本专利技术的肽，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、细 菌细胞和酵母。本专利技术的特征还在于具有编码E-选择蛋白肽的核苷酸序列的杆 状病毒，具有编码E-选择蛋白肽的核苷酸序列的载体，或者包括编 码与编码E-选择蛋白肽的核酸连接的杆状病毒信号肽的DNA节段的 重组杆状病毒转移载体。所述DNA序列所处位置使得编码的E-选择 蛋白肽与编码的信号肽框内翻译。这种重组杆状病毒转移载体优选与杆状病毒启动子可操纵地连接以在宿主细胞中表达编码E-选择蛋白 肽的核酸。所述宿主细胞可包括昆虫细胞、细菌细胞和哺乳动物细胞。 优选地，所述重组杆状病毒转移载体包括用于将本专利技术的E-选择蛋 白肽分泌进所述昆虫宿主细胞的培养基中的序列。本专利技术的特征还在于具有一或多种E-选择蛋白肽或者核苷酸和 载体(优选药物可接受的载体)的组合物。包括E-选择蛋白肽或者 编码E-选择蛋白肽的核苷酸的分离的细胞和细胞组合物也是本专利技术 的一部分。可用的细胞包括哺乳动物细胞、细菌细胞和昆虫细胞，优 选昆虫细胞。本专利技术进一步特征在于一种生产本专利技术的E-选择蛋白肽的方法。 这种方法包括从构建一种包括编码与编码E-选择蛋白肽的核酸连接 的杆状病毒信号肽的DNA节段的重组转移载体开始，使得所述信号 序列和编码E-选择蛋白肽的核酸框内翻译。所述编码杆状病毒信号 肽的DNA节段与杆状病毒启动子可操纵地连接，以在昆虫细胞中表 达和分泌E-选择蛋白肽。将第一种昆虫细胞用所述重组转移载体和 杆状病毒DNA共转染以产生重组杆状病毒。收获所述重组杆状病毒。 将第二种昆虫细胞用所述收获的重组杆状病毒感染。将感染的昆虫细 胞在培养基中培养以表达和分泌E-选择蛋白肽。收集所述培养基并 进行纯化以收集所述E-选择蛋白肽。本专利技术还包括一种通过诱导对可溶的E-选择蛋白肽的粘膜耐受 性而治疗个体中炎症介导的疾病或病变的方法。这可以通过经鼻或口 腔途径多次给予个体低剂量的E-选择蛋白而实现。附图简述本专利技术的目的和特征参考以下的详细描述和附图可得以更好地 理解。附图说明图1 (SEQ ID NO: 8)是推测的重组人E-选择蛋白肽的氨基酸序列和蛋白质结构功能alde本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自如下一组的分离的哺乳动物肽：基本上由野生型人Ｅ选择蛋白（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１）的第２０－３０３位残基组成的肽，附着于一或多个Ｃ末端标记的基本上由野生型人Ｅ选择蛋白（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１）的第２０－３０３位残基组成的肽，附着于羧基末端二肽ＲＳ的基本上由野生型人Ｅ选择蛋白（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１）的第２０－３０３位残基组成的肽，附着于Ｎ末端分泌性信号肽的基本上由野生型人Ｅ选择蛋白（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１）的第２０－３０３位残基组成的肽，及由与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１具有至少６０％相同性的２００－４００个氨基酸组成的肽，及前述肽的混合物或组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G史密斯，P普什科，V科伊斯，
申请(专利权)人：诺瓦瓦克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]