本发明专利技术涉及生物制药技术领域，具体涉及一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基的制备。本发明专利技术针对昆虫细胞Sf-9细胞的生长的特点，研制适合Sf-9细胞高密度悬浮培养的低成本、无血清、无动物源、低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使Sf-9细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物制药
，具体设及一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动 物源培养基的制备。
技术介绍
杆状病毒表达系统化aculovirusexpressionsystem)是近年来应用较多的真核 表达系统，它可W在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆 状病毒是一类W昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊 椎动物，对人、畜无害。杆状病毒表达系统的主要优越性有如下特点： ①表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键； ②翻译后可进行修饰加工如糖基化、憐酸化、酷胺化及信号肤切割等，使重组蛋白 在结构和功能上更接近天然蛋白； 阳〇化]③与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可W高效表达外源基因，表达量 最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50% ; ④可W容纳大片段外源基因。 目前研究较多的是首猜银纹夜蛾核多角体病毒（AcNPV)，其宿主是草地贪夜 蛾，而Sf-9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞之一。Sf-9细胞，即：Spodoptera 化ugiperda(草地夜蛾）卵巢细胞，是由G.E.Smith和C.L.化er巧在1983年从细胞株 IPLB-SF21AE得来的一个克隆。IPLB-SF21AE是1977年由Vau曲η等从草地夜蛾蛹的 卵巢组织得到的。Sf-9细胞属于半贴壁型细胞系，可W进行悬浮培养，也可W进行贴壁培 养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。早些年间Sf-9细胞的培养基常 为TNM-iW培养液，即在Grace'SAntheraea培养液的基础上，每升培养液加3. 3g酵母粉和 3. 3g乳白蛋白水解物，用1MK0H调抑到6. 2-6. 4过滤除菌，完整培养液在使用前加入10% 热灭活的胎牛血清。 相对于添加血清的培养，无血清悬浮培养是最为先进的工艺。无血清培养基相比 有血清培养基具有诸多优势：1)可避免血清的外源性污染，因为动物来源血清常携带病毒 或支原体；2)可克服血清批次间的差异性，使细胞培养性能更加稳定，能提高结果的重复 性；如成分相对明确，有利于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等一系列细胞行 为；4)可简化下游目的产物的分离纯化，节省成本。 目前，国外的无血清培养基产品价格高且配方保密，同时国内外均缺少专口针对 昆虫细胞Sf-9细胞培养的无血清培养基，而且培养基性能较差，不能持续的维持细胞的活 力，或者是成本较高。己斯福股份公司申请的中国专利申请公开号CN1498267A，其所生产 的培养基为液体培养基，对于运输和放菌要求极高，并且价格昂贵，不适合我国的目前的培 养基发展状况。本专利技术基于上述状况，开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是 将一些脂类经过了特殊处理之后，能W固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得 24化的连续生长，细胞活力能保持在95%W上。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种针对我国工业生产所用昆虫细 胞Sf-9细胞的生长的特点，研制适合Sf-9细胞高密度悬浮培养的低成本、无血清、无动物 源、低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清 的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基 组分的优化，使Sf-9细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适 合于规模化工业生产。 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：提供一种适合悬浮培养Sf-9细 胞的无血清无动物源培养基，其特征在于，所述培养基中包括下列含量的原料物质： (1)氨基酸部分： 阳〇1引 k丙氨酸lOO-SOOmg/l, 心谷氨酷胺 900-5500mg/l， k精氨酸盐酸盐 700-2500mg/l， 心天冬氨酸 900-1700mg/l, 心天冬酷胺SOO-lSOOmg/l， k半脫氨酸一水合物120-320mg/l， k谷氨酸l3〇〇-28〇Omg/l, 心异亮氨酸 40〇-l3〇Omg/l， k亮氨酸 3〇〇-75〇mg/l， k赖氨酸盐酸盐 400-1600mg/l， k蛋氨酸 600-1650mg/l, k苯丙氨酸 700-1800mg/X, 阳0巧]k脯氨酸 300-1000mg/l， k丝氨酸 200-1050mg/l, k苏氨酸 200-900mg/l， k色氨酸 100-400mg/l, k酪氨酸二钢盐 200-900mg/l， k鄉氨酸 300-980mg/l， k脫氨酸盐酸盐50-85mg/l， k组氨酸盐酸盐 100-250mg/l， k赖氨酸 300-1000mg/l, 甘氨酸 200-900mg/L; 阳0对 似无机盐部分： 四水钢酸锭0. 01-加邑/1， 无水氯化巧 100-950mg/l， 氯化钢 1000-7500mg/l, 憐酸氨二钢 10-45mg/l， 六水氯化儀 500-800mg/l, 无水硫酸儀 200-900mg/l， 氯化钟 400-2350mg/l, 一水憐酸二氨钢 800-1500mg/l, 屯水合硫酸锋0. 1-0. 7mg/l， 亚砸酸钢 0.01-0. 〇3mg/l, 硫酸亚铁0. 01-0.加邑/1， 碳酸氨钢 100-900mg/L; W48] 0)维生素部分：生物素 0.005-0.Olmg/l, 阳化0]维生素B12 0. 1-0.Smg/l, 氯化胆碱 0.S-Smg/l, D-泛酸巧0. 2-加邑/1， 叶酸 0. 2-5mg/X, 烟酷胺 5-8mg/l， 阳化5] 盐酸[I比唉醇5-8mg/l, 憐酸化唉醒 0.oe-o. 3mg/l， 核黄素 0. 08-0. 6mg/l， 钻胺素 0. 04-3mg/l， 盐酸硫胺素 0. 05-0. 5mg/l， 柳6〇]肌醇 5-8mg/L; (4)脂类添加部分： 柳创 亚油酸0. 1-0. 3mg/l， 阳〇6；3] 大豆卵憐脂IS-Wmg/l, 柳64]胆固醇 20-60mg/l， 阳0化]腐胺 0. 04-0.Smg/X, 乙醇胺 5-40mg/l， 无水乙醇 0. 5-2ml/L; (5)水解物添加部分： 大豆水解物 500-4000mg/l, 酵母超滤物 500-4000mg/l, 大米水解物 500-2000mg/l， (6)其余添加物部分： D-葡萄糖 3〇0〇-6〇OOmg/l, 丙酬酸钢 10〇-25〇mg/l， 阳0巧]硫辛酸0.OS-O.emg/l， 胸巧 0. 06-0. 5mg/l, 腺嚷岭 0.l-5mg/l， 胸腺喀晚 0. 02-2mg/l， 重组膜岛素3-25mg/l， 巧樣酸铁 0. 02-lmg/l， 环庚Ξ締酪酬 0.l-8mg/l， F-68 50-600mg/l, 还原型谷脫甘肤0. 01-0. 9mg/l， 次黄嚷岭钢盐0.l-5mg/L。 其中，F-68是pluronicF-68的简称，在细胞培养过程中的常用添加物，对细胞具 有保护作用。 关于"大豆水解物"、"酵母超滤物及"大米水解物"在本领域中有公认的含义， 就是将大豆，酵母，大米，经过特殊的工艺，包括酶消化、酸处理等手段进行处理后，提取适 合细胞生长组分，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适合悬浮培养昆虫细胞的无血清、无动物源培养基，其特征在于，所述培养基中包括下列含量的原料物质：(1)氨基酸部分：L‑丙氨酸100‑500mg/L,L‑谷氨酰胺900‑5500mg/L,L‑精氨酸盐酸盐700‑2500mg/L,L‑天冬氨酸900‑1700mg/L,L‑天冬酰胺800‑1800mg/L,L‑半胱氨酸一水合物120‑320mg/L,L‑谷氨酸1300‑2800mg/L,L‑异亮氨酸400‑1300mg/L,L‑亮氨酸300‑750mg/L,L‑赖氨酸盐酸盐400‑1600mg/L,L‑蛋氨酸600‑1650mg/L,L‑苯丙氨酸700‑1800mg/L,L‑脯氨酸300‑1000mg/L,L‑丝氨酸200‑1050mg/L,L‑苏氨酸200‑900mg/L,L‑色氨酸100‑400mg/L,L‑酪氨酸二钠盐200‑900mg/L,L‑缬氨酸300‑980mg/L,L‑胱氨酸盐酸盐50‑85mg/L,L‑组氨酸盐酸盐100‑250mg/L,L‑赖氨酸300‑1000mg/L,甘氨酸200‑900mg/L；(2)无机盐部分：四水钼酸铵0.01‑2mg/L,无水氯化钙100‑950mg/L,氯化钠1000‑7500mg/L,磷酸氢二钠10‑45mg/L,六水氯化镁500‑800mg/L,无水硫酸镁200‑900mg/L,氯化钾400‑2350mg/L,一水磷酸二氢钠800‑1500mg/L,七水合硫酸锌0.1‑0.7mg/L,亚硒酸钠0.01‑0.03mg/L,硫酸亚铁0.01‑0.2mg/L,碳酸氢钠100‑900mg/L；(3)维生素部分：生物素0.005‑0.01mg/L,维生素B12 0.1‑0.8mg/L,氯化胆碱0.5‑5mg/L,D‑泛酸钙0.2‑2mg/L,叶酸0.2‑5mg/L,烟酰胺5‑8mg/L,盐酸吡哆醇5‑8mg/L,磷酸吡哆醛0.06‑0.3mg/L,核黄素0.08‑0.6mg/L,钻胺素0.04‑3mg/L,盐酸硫胺素0.05‑0.5mg/L,肌醇5‑8mg/L；(4)脂类添加部分：亚油酸0.1‑0.3mg/L,大豆卵磷脂15‑20mg/L,胆固醇20‑60mg/L,腐胺0.04‑0.8mg/L,乙醇胺5‑40mg/L,无水乙醇0.5‑2ml/L；(5)水解物添加部分：大豆水解物500‑4000mg/L,酵母超滤物500‑4000mg/L,大米水解物500‑2000mg/L,(6)其余添加物部分：D‑葡萄糖3000‑6000mg/L,丙酮酸钠100‑250mg/L,硫辛酸0.05‑0.6mg/L,胸苷0.06‑0.5mg/L,腺嘌呤0.1‑5mg/L,胸腺嘧啶0.02‑2mg/L,重组胰岛素3‑25mg/L,柠檬酸铁0.02‑1mg/L,环庚三烯酚酮0.1‑8mg/L,F‑68 50‑600mg/L,还原型谷胱甘肽0.01‑0.9mg/L,次黄嘌呤钠盐0.1‑5mg/L。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵峻岭，苏广华，黄新朋，
申请(专利权)人：内蒙古金源康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
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