逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法技术

本发明专利技术的制备方法采用克隆PCV2 Cap基因杆状病毒表面展示载体连接，并加上哺乳动物启动子CAGG及报告基因eGFP获得重组转移载体；重组转移载体通过Tn7 转座获得重组杆状病毒Bacmid 载体；重组Bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Western blot 分析和共聚焦显微镜分析；并把重组杆状病毒与猪血清作用，发现了与不展示Cap的病毒相比具有很强的逃逸补体清除的能力，从而提高疫苗免疫效力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种PCV2Cap蛋白重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备方法。
技术介绍
杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒，可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白，制备疫苗。研究发现，在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值，对细胞毒性小，转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因，哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰，表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此，杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体，用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体，具有巨大潜力，日益受到人们的关注。杆状病毒能够进入哺乳动物体内的某些细胞，但是在这些细胞内不能进行复制。研究人员利用这个特点将其改造为一个携带基因的工具，并进行一定的修饰加工，将其改造成定向携带的载体，携带基因、药物到达指定的部位。但是，杆状病毒对机体来说毕竟是一个异类，机体对它有免疫作用，这不利于病毒进入指定部位，为了解决这个问题，就在杆状病毒基因内部引入了补体抑制分子，补体抑制分子的引入能够抑制机体对重组病毒的免疫应答，使杆状病毒重组体在传输过程中经过血清时被消灭的危险。CAGG启动子，它是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒（thecytomegalovirus，CMV)早期增强子（earlyenhancerelement）和鸡β-肌动蛋白（chickenbeta-actin）启动子组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。它不仅比CMV启动子活性高，而且具有广谱的宿主范围，所以加入到载体上能诱导更强蛋白表达。猪圆环病毒(PCV，Porcinecircovirus)是断奶后仔猪多系统衰竭综合征（Postweaningmultisystemicwastingsyndrorne，PMWS）的主要病原，是一种消耗性疾病，够引起机体的免疫抑制，其抗原蛋白主要是Cap蛋白，通过酵母双杂交已经发现其可以与MKRN1、gClqR、Par-4、NAPl、NPMl和Hsp40发生相互作用，gC1qR是C1q球头部的一种免疫受体蛋白，而C1q是补体系统中C1复合物的第一个成分，它在固有免疫中发挥至关重要的作用，参与宿主细胞的防御。有文献报道gClqR的配体-补体因子ClqB也可与Cap蛋白互作由此，推测：Cap、ClqB和gClqR很可能形成一个三元复合物发挥功能。C1QBP是补体系统中一个重要调控蛋白，之前通过免疫共沉淀证明了PCV2Cap蛋白与C1QBP之间可以相互作用。C1QBP高度表达在活化的血小板上，部分参与了激活补体过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法，通过以下步骤完成：1)克隆PCV2Cap基因，与杆状病毒表面展示载体连接，CAGG启动子与eGFP的连接，并与表面展示载体相连，获得重组转移载体；2)重组转移载体通过Tn7转座获得重组杆状病毒Bacmid载体；3)重组Bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，观察细胞病变并提取病毒DNA做PCR鉴定；4)重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Westernblot分析和共聚焦显微镜分析；5)重组杆状病毒做补体拮抗活性检测。所述的步骤1)中猪PCV2Cap基因的序列为序列表中的SEQIDNO:1；其对应的猪PCV2Cap的氨基酸序列为SEQIDNO:3。所述的步骤1)eGFP基因的序列为序列表中的SEQIDNO:2；其对应的eGFP氨基酸序列为SEQIDNO:4。所述的步骤1)中eGFP基因的表达受CAGG启动子的控制。所述的步骤2)中Bacmid载体含苜蓿银文夜蛾核型多角体病毒基因组。所述的步骤3)中昆虫细胞为草地夜蛾卵巢细胞sf9。所述的步骤4)中Westernblot分析的步骤为：收集病毒感染的昆虫细胞，用细胞裂解液处理后与蛋白上样缓冲液混合，煮沸10min后吸取上清做SDS-PAGE电泳；将PVDF膜浸泡在100％甲醇中，10s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀10min；蛋白质电泳结束后，利用电转仪将蛋白质转印在PVDF膜上；将转印好的PVDF膜以含50g/L脱脂牛乳室温封闭1h，以洗涤缓冲液清洗3次；用稀释的His标签鼠单克隆抗体4℃下摇床孵育过夜，隔日以适量洗涤液清洗3次；加入稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温下摇床作用1h后，以适量洗涤液清洗3次；用蒸馏水清洗，取出PVDF膜，稍晾干，暗房进行化学发光反应(ECL)，等量ECL试剂I:II＝1:1，覆盖在PVDF膜上反应1min后，进行X光显影分析。所述的步骤4)中共聚焦显微镜分析的步骤为：在6孔培养板中放入无菌载玻片，细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量为每孔加入1×106；细胞吸附1h后，吸弃培养基，加入重组病毒在MOI＝10下感染；48h后吸弃培养基，再添加1mL的甲醇：丙酮＝1:1的混合液于―20℃冰箱下固定5min，之后再加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗2次，每次5min；以1mL的20mL/L牛血清白蛋白在37℃下反应30min；加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次,每次5min；接下来加入His抗体(1:100)在37℃下反应1h，以标定表面展示的Cap；加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，再加入FITC标记的兔抗鼠IgG(1:100)37℃下反应1h；加入1mLPBS缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，在共聚焦显微镜下观察，展示蛋白的细胞膜会被FITC染色而呈现绿色荧光。所述的步骤5)中补体拮抗活性检测的方法为：采健康猪前腔静脉血分离血清，血清分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活；将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度；病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术的一个优点在于，利用展示的Cap提高对血清补体的拮抗能力，而且有利于与抗原呈递细胞的结合提高免疫效力的拮抗能力；本专利技术的另一个优点在于，CAGG启动子的高效转导能力。附图说明从下面结合附图的详细描述中，本专利技术的上述特征和优点将更明显，其中：图1.重组杆状病毒转移载体结构示意图。图2.WesternBlot分析Cap蛋白表达结果图。图3.共聚焦显微镜分析Cap在细胞中的位置结果图，其中，A代表自然光图片，B代表FITC荧光图片，C代表叠加图片。图4.重组病毒对血清补体灭活的拮抗作用结果图。图5.重组杆状病毒感染Sf9细胞后的eGFP表达情况。具体实施方式以下通过实施例及附图来进一步阐明本专利技术的表面展示猪Cap重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备。以下实施例只是举例说明来帮助本领域的技术人员进一步理解，但不限制本专利技术。本领域的技术人员在不脱离本专利技术构思的前提下可进行修改和改进。实施例11.杆状病毒表面展示载体的构建及验证以PCV2病毒DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法，通过以下步骤完成：1) 克隆PCV2 Cap基因，与杆状病毒表面展示载体连接，CAGG启动子与eGFP的连接，并与表面展示载体相连，获得重组转移载体；2) 重组转移载体通过Tn7 转座获得重组杆状病毒Bacmid 载体；3) 重组Bacmid 用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，观察细胞病变并提取病毒DNA 做PCR 鉴定；4) 重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Western blot 分析和共聚焦显微镜分析；5) 重组杆状病毒做补体拮抗活性检测。

【技术特征摘要】
1.一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法，通过以下步骤完成：1)克隆PCV2Cap基因，与杆状病毒表面展示载体连接，CAGG启动子与eGFP的连接，并与表面展示载体相连，获得重组转移载体；2)重组转移载体通过Tn7转座获得重组杆状病毒Bacmid载体；3)重组Bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，观察细胞病变并提取病毒DNA做PCR鉴定；4)重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Westernblot分析和共聚焦显微镜分析；5)重组杆状病毒做补体拮抗活性检测。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中猪PCV2Cap基因的序列为序列表中的SEQIDNO:1；其对应的猪PCV2Cap的氨基酸序列为SEQIDNO:3。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)eGFP基因的序列为序列表中的SEQIDNO:2；其对应的eGFP氨基酸序列为SEQIDNO:4。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中eGFP基因的表达受CAGG启动子的控制。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)中Bacmid载体含苜蓿银文夜蛾核型多角体病毒基因组；所述的步骤3)中昆虫细胞为草地夜蛾卵巢细胞sf9。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤4)中Westernblot分析的步骤为：收集病毒感染的昆虫细胞，用细胞裂解液处理后与蛋白上样缓冲液混合，煮沸10min后吸取上清做SDS-PAGE电泳；将PVDF膜浸泡在100％甲醇中，10s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀10min；蛋白质电泳结束后，利用电转仪将蛋白质转印在PVDF膜上；将转印好的PVDF膜以含50g/L脱脂牛乳室温封闭1h，以洗涤缓冲液清洗3次；用稀释的His标签鼠单克隆抗体4℃下摇床孵育过夜，隔日以适量洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，薛青红，陈瑞，张元元，张志刚，董剑辉，戚伟强，孙丰廷，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：陕西;61