一种羊口疮病毒LAMP检测引物及LAMP检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种羊口疮病毒LAMP检测引物及其试剂盒，所述LAMP检测引物针对羊口疮病毒保守的VIR序列，能够特异性的检测羊口疮病毒；且采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖；该LAMP检测试剂盒可以实现羊口疮病毒的快速现场检测，检测结果可以直接目测，适合现场检测；所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的羊口疮病毒的基层检测手段。

A primer for LAMP detection of sheep aphthous ulcer virus and a LAMP detection kit

【技术实现步骤摘要】
一种羊口疮病毒LAMP检测引物及LAMP检测试剂盒
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种羊口疮病毒的LAMP检测引物及检测试剂盒。
技术介绍
：羊口疮疾病是由羊口疮病毒引起的一种急性、接触性、嗜上皮性传染病。患病羊主要表现在口唇部严重溃烂、结痂，导致其采食困难，营养摄入不足，大大降低了成年山羊生产性能和羔羊的生长发育。羊口疮疾病是目前世界上流行最为广泛的病毒病之一，主要感染山羊、绵羊等小型反刍动物，调查发现羊口疮疾病的发病率在羔羊中高达100%，由二次感染导致的死亡率也达到15%，到目前为止，高的发病率与死亡率已经给养羊业带来了巨大的经济损失。但是由于羊口疮病毒独特的免疫逃避机制，反复感染特性以及当前市场上没有合适的治疗药物，疫苗生产又处于“有苗无货”的尴尬状态，羊口疮疾病的防治仍然是世界范围内的难题。羊口疮近年来在我国各地山羊养殖场发生的频度不断上升，给养殖业造成严重的的经济损失。但迄今为止，关于我国羊口疮疾病的流行病学特点还不甚清楚。临床上，羊口疮病毒产生特征性损伤，依次是丘疹，水泡，脓包，结痂的形成。脓包的产生时间很短，且脓包的破裂会导致溃疡形成，伴随而行的就是厚层痂皮的形成。这些非典型个例身体部分的损伤在诊断时可能会产生混乱。同样，溃疡性损伤会与口蹄疫（FMD）混淆，尤其是在绵羊身上。在2001年发生在英国的一例疑似FMD的病例诊断中，羊口疮就是一个被考虑在内，这也暗示了实验室诊断的必要性。羊口疮感染同时也需要同山羊痘病毒感染区分开来，因为他们都产生相似的临床症状，偶尔也要与蓝舌病进行区分。根据临床症状能够很容易的诊断出来，然而，临床损害有时候会与其他病毒疾病比如口蹄疫（FMD），少数情况下的蓝舌病或者细菌病比如葡萄球菌性皮炎或者噬皮菌病。在这些情况下，实验室诊断是非常必要的。实验室检测经常用用到的方法包括：电镜观察，ELISA，细胞转染（CFT）和血清中和试验；感染组织的组织病理学；以及核酸检测，包括PCR和实时定量PCR（RFLP）。专利技术专利申请CN201210123595.0公开了一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒；专利技术专利申请CN201610542627.9公开了一种山羊痘病毒和羊口疮病毒多重PCR检测引物，能够在1个反应体系中快速鉴定山羊痘病毒和羊口疮病毒，而且可以同时确定是否为这两种病毒混合感染，在临床样品快速筛检和疾病快速确诊等方面有重要的应用价值；专利技术专利申请CN201610397352.4公开了一种用于鉴别羊口疮病毒和羊痘病毒的二重PCR检测试剂盒。然而，以上核酸检测方法虽然能够实现羊口疮病毒的准确检测，但是其都是属于实验室检测手段，需要借助复杂的仪器和严苛的实验条件，并不适合大规模的流行病学调查和运用到基层单位的现场检测，例如乡镇一级或者县级的兽医检测通常不配备PCR或荧光定量PCR仪器和相关操作人员。专利技术专利申请CN201210183987.6公开了一种羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法，其利用犊牛睾丸原代细胞，通过羊口疮病毒的连续传代培养，获得的第六代细胞培养液作为原核克隆的模板，通过原核表达获得可溶性表达蛋白，其表达的蛋白作为包被抗原，制备羊口疮抗体检测试剂盒，通过分析确定羊口疮的流行病学特点，为羊口疮流行病学调查提供依据。专利技术专利申请CN201810805441.7公开了一种羊口疮病毒抗体间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用，该检测方法中涉及一种试剂盒，所述试剂盒以ORFV-B2Ls表达蛋白为包被抗原，表达并纯化了可性的B2L蛋白表达，使其具有良好的生物学活性；可用于羊口疮病毒抗体的检测。以上免疫学检测手段虽然无需借助昂贵的核酸检测仪器，但是，其不能检测病毒本身，不能有效的区分病毒感染导致的血清学阳性还是由于疫苗接种导致的血清学阳性。因此，申请人针对羊口疮检测中存在的问题，开展了羊口疮病原的快速检测方法的多项研究，采用多种检测手段，旨在解决流行病学调查和基层检测中不方便的问题。
技术实现思路
：为了解决羊口疮病毒血清学检测方法不能区分病毒感染或是疫苗接种的情形，而常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测等技术问题，本专利技术旨在提供一种羊口疮病毒LAMP检测引物及其试剂盒，所述LAMP检测引物针对羊口疮病毒保守的VIR序列，能够特异性的检测羊口疮病毒；且采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖；该LAMP检测试剂盒可以实现羊口疮病毒的快速现场检测，检测结果可以直接目测，适合现场检测；所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的羊口疮病毒的基层检测手段。为了实现上述目的，本专利技术提供羊口疮病毒LAMP检测引物组，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：外引物：ORFV-F3AGAGGCTGGGTGCGATAC（SEQIDNO:1）ORFV-B3GCAACGACCTTTCCGGATA（SEQIDNO:2）内引物：ORFV-FIPACCGCACTGACCGGGTTAAGAGCGACATCGACATCATGACT（SEQIDNO:3）ORFV-BIPTAGAGTTCTGCGAGACGCGTTC-GTGATGGTGCAGGTGAAGA（SEQIDNO:4）环引物：ORFV-LFGCGCATCACGGAAGACTG（SEQIDNO:5）ORFV-LBTGGCGGCAAGGATCACT（SEQIDNO:6）。本专利技术另提供一种羊口疮病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组。所述试剂盒包含以上所述的引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。所述外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:10。所述LAMP反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。所述阳性对照为含有目的基因VIR片段的质粒DNA，所述目的基因VIR片段的序列如SEQIDNo.7所示；所述阴性对照为去离子水。本专利技术另提供一种羊口疮病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：（1）提取待测样品DNA；（2）环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有以上所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后于64℃下反应35min；（3）结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带，如反应管中溶液变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带则判定为阳性，否则为阴性。所述方法可以用于诊断目的，例如羊场中羊口疮病毒的流行病学调查；也可以用于非诊断目的，例如羊口疮病毒的实验室确认，或者新鲜羊肉或羊血中是否存在病毒污染。基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：第一，本专利技术基于LAMP技术特异性高的特点，所设计的引物仅能特异性扩增羊口疮病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行。选取羊口疮病毒的保守基因序列VIR作为检测的目标基因，干扰素抗性基因VIR定位在ORFV基因组的左边末端，编码单链RNA结合蛋白，此蛋白抑制interferons的抗病毒活性，该VIR基因高度保守，可以保证检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羊口疮病毒LAMP 检测引物组，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：外引物：ORFV‑F3     AGAGGCTGGGTGCGATAC （SEQ ID NO:1）ORFV‑B3     GCAACGACCTTTCCGGATA（SEQ ID NO:2）内引物：ORFV‑FIP    ACCGCACTGACCGGGTTAAGAGCGACATCGACATCATGACT（SEQ ID NO:3）ORFV‑BIP    TAGAGTTCTGCGAGACGCGTTC‑GTGATGGTGCAGGTGAAGA（SEQ ID NO:4）环引物：ORFV‑LF     GCGCATCACGGAAGACTG（SEQ ID NO:5）ORFV‑LB     TGGCGGCAAGGATCACT（SEQ ID NO:6）。

【技术特征摘要】
1.一种羊口疮病毒LAMP检测引物组，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：外引物：ORFV-F3AGAGGCTGGGTGCGATAC（SEQIDNO:1）ORFV-B3GCAACGACCTTTCCGGATA（SEQIDNO:2）内引物：ORFV-FIPACCGCACTGACCGGGTTAAGAGCGACATCGACATCATGACT（SEQIDNO:3）ORFV-BIPTAGAGTTCTGCGAGACGCGTTC-GTGATGGTGCAGGTGAAGA（SEQIDNO:4）环引物：ORFV-LFGCGCATCACGGAAGACTG（SEQIDNO:5）ORFV-LBTGGCGGCAAGGATCACT（SEQIDNO:6）。2.一种羊口疮病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的羊口疮病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求3所述的羊口疮病毒LAMP检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴玉江，四朗玉珍，索朗达，巴贵，次仁德吉，德吉，张靖飞，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：陕西,61