检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术技术领域，特别涉及一种检测猪Pegivirus的套式RT‑PCR引物组、试剂盒及应用。所述的检测猪Pegivirus的套式RT‑PCR引物组，其特征在于包含外围引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，本发明专利技术还提供了一种包含上述引物组的试剂盒，该试剂盒采用一步法RT‑PCR和套式PCR相互配合，可高效、快速、特异地扩增目标序列，适用于疫病病原确诊和病原净化检测，例如：出入境现场、养殖场等。

Nested RT-PCR primers, kit and application for detection of swine Pegivirus

【技术实现步骤摘要】
检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用
本专利技术涉及生物技术
，特别涉及一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用。
技术介绍
Pegivirus(发音为peh-gee病毒)是一种新出现的从发病动物的血清中分离的病毒。Pegivirus是小包膜的单链正义RNA病毒，其基因组大小为9～13kb核苷酸，基因组表征已将所有已知的Pegivirus分类为黄病毒科佩吉病毒属中的11种(A-K)。猪Pegivirus(PPgV)属于PegivirusK的成员。Pegivirus可感染包括人类、灵长类动物、猪、马、啮齿动物和蝙蝠等多种哺乳动物。但大多数Pegivirus的致病性是未知的，据报道仅PegivirusD可引起急性马肝炎或马的血清相关性肝炎。尽管PPgV阳性的猪表现出跛足和水疱等特征性临床症状，但先前的研究报道表明，在PPgV的动物致病性研究中，PPgV对感染猪没有明显的临床效果，因此PPgV感染与任何特定临床疾病之间的关联有待进一步研究。来自德国和美国的猪中检测到猪的Pegivirus，表明PPgV的广泛的地理分布。已有文献报道我国猪群中已经检测到Pegivirus，而目前，我国鲜有关于PPgV研究的相关报道。针对目前该病的确诊和扩散控制，急需提出和制定快速的诊断方法与有效的防控策略。
技术实现思路
为了克服现有技术中缺少检测PPgV成熟技术方案的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，该引物组能快速、准确、高效地检测鉴定PPgV，特异性好，灵敏度高。本专利技术的另一目的在于提供一种检测猪Pegivirus的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，该试剂盒可高效、准确地检测鉴定PPgV。本专利技术的再一目的在于提供上述检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组和试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，包含外围引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如下所示：引物PPgV–F1：5′-ACGGTTGGWCGTTTGAGGAG-3′；引物PPgV–R1：5′-ACAAGCGGAAAGTGACAKGAAT-3′；引物PPgV–F2：5′-CACCCYTTTATGCTTACTGCC-3′；引物PPgV–R2：5′-CCCRCGAGCRAAAATCATACC-3′；其中，K、Y、R和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T；所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用；所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；一种检测猪Pegivirus的试剂盒，包含上述检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组；所述的检测PPgV的试剂盒还包含PrimerScript1stepEnzymeMix、2×1stepBuffer、RNaseFreeddH2O、TaKaRaTaq、dNTPMixture、10×PCRBuffer(Mg2++plus)；所述的检测PPgV的试剂盒进一步优选包含PrimerScript1stepEnzymeMix、2×1stepBuffer、RNaseFreeddH2O、TaKaRaTaq、dNTPMixture、10×PCRBuffer(Mg2++plus)；浓度为10μmol/L的PPgV–F1、浓度为10μmol/L的PPgV–R1、浓度为10μmol/L的PPgV–F2、浓度为10μmol/L的PPgV–R2；所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用；所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，包含如下步骤：(1)以待测样品RNA为模板，以引物PPgV–F1和引物PPgV–R1为扩增引物，配制一步法RT-PCR反应体系，进行RT-PCR反应；(2)以步骤(1)制得的RT-PCR反应产物为模板，以引物PPgV–F2和引物PPgV–R2为扩增引物，配制套式PCR反应体系，进行套式PCR反应；(3)将步骤(2)制得的套式PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在870bp处出现目的条带的判定为阳性扩增，在870bp处未出现目的条带的判定为阴性扩增；步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应体系优选为：步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应参数如下所示：50℃逆转录反应30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min；步骤(2)中所述的套式PCR反应的反应体系优选为：步骤(2)中所述的套式PCR反应的参数如下所示：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min；所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，适用于PPgV的确诊和净化检测。(2)本专利技术提供的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组和试剂盒采用一步法RT-PCR和套式PCR相互配合，该反应机制可高效、快速、特异地扩增目标序列。(3)本专利技术提供的检测猪Pegivirus的试剂盒扩增效率高且特异性强。(4)本专利技术提供的检测猪Pegivirus的试剂盒非常适用于疫病病原确诊和病原净化检测，例如：出入境现场、养殖场等。附图说明图1是外围引物一步法RT-PCR反应产物电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarkerDL2000，泳道1～3分别代表阳性对照、被检样品、阴性对照。图2是内围引物套式PCR反应产物电泳结果图；其中，泳道M为DNAMarkerDL2000，泳道1～3分别代表阳性对照、被检样品、阴性对照。图3是外围引物一步法RT-PCR和内围引物套式PCR敏感性结果分析图；其中，泳道Ma为DNAMarkerDL2000、Mb为DNAMarkerDL1000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b、8a/8b、9a/9b、10a/10b、11a/11b、12a/12b分别代表初始核酸浓度、101倍倍比核酸稀释浓度、102倍倍比核酸稀释浓度、103倍倍比核酸稀释浓度、104倍倍比核酸稀释浓度、105倍倍比核酸稀释浓度、106倍倍比核酸稀释浓度、107倍倍比核酸稀释浓度、108倍倍比核酸稀释浓度、109倍倍比核酸稀释浓度、1010倍倍比核酸稀释浓度、1011倍倍比核酸稀释浓度和阴性对照的反应产物的一步法RT-PCR和套式PCR电泳结果。图4是外围引物一步法RT-PCR和内围引物套式PCR特异性结果分析图；其中泳道Ma为DNAMarkerDL2000、Mb为DNAMarkerDL1000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪Pegivirus的套式RT‑PCR引物组，其特征在于包含外围引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如下所示：引物PPgV–F1：5′‑ACGGTTGGWCGTTTGAGGAG‑3′；引物PPgV–R1：5′‑ACAAGCGGAAAGTGACAKGAAT‑3′；引物PPgV–F2：5′‑CACCCYTTTATGCTTACTGCC‑3′；引物PPgV–R2：5′‑CCCRCGAGCRAAAATCATACC‑3′；其中，K、Y、R、和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，其特征在于包含外围引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如下所示：引物PPgV–F1：5′-ACGGTTGGWCGTTTGAGGAG-3′；引物PPgV–R1：5′-ACAAGCGGAAAGTGACAKGAAT-3′；引物PPgV–F2：5′-CACCCYTTTATGCTTACTGCC-3′；引物PPgV–R2：5′-CCCRCGAGCRAAAATCATACC-3′；其中，K、Y、R、和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T。2.权利要求1所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用。3.一种检测猪Pegivirus的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组。4.根据权利要求3所述的检测PPgV的试剂盒，其特征在于还包含PrimerScript1stepEnzymeMix、2×1stepBuffer、RNaseFreeddH2O、TaKaRaTaq、dNTPMixture、10×PCRBuffer。5.根据权利要求4所述的检测PPgV的试剂盒，其特征在于包含PrimerScript1stepEnzymeMix、2×1stepBuffer、RNaseFreeddH2O、TaKaRaTaq、dNTPMixture、10×PCRBuffer；浓度为10μmol/L的PPgV–F1、浓度为10μmol/L的PPgV–R1、浓度为10μmol/L的PPgV–F2、浓度为10μmol/L的PPgV–R2。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，李锦辉，谢永生，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44