本发明专利技术公开一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法，涉及分子生物学检测技术领域。所述鸭源病毒检测试剂盒包括用于检测10种鸭源病毒的PCR引物及质量探针；本发明专利技术还提供一种可同时检测10种鸭源病毒的检测方法，该方法至少包括多重PCR、质量探针延伸、质谱分析检测步骤，该方法灵敏度高、成本低、特异性好，可以实现不同鸭源病毒的多重检测。
Detection Kit and Detection Method of Duck Virus Based on Site-specific Gene Mass Spectrometry
【技术实现步骤摘要】
基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学检测
更具体地，涉及一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
鸭病毒病是危害养鸭业的主要疫病。鸭肝炎病毒、鸭星状病毒、鸭肠炎病毒和鸭呼肠孤病毒是引起鸭病的经典毒株。20世纪90年代以来，禽流感病毒称为危害养鸭业的重要病原。近年来，我国鸭群中出现了许多新的病毒病，给养鸭业造成了巨大的经济损失。例如，番鸭“白点病”、由新型鸭肝炎病毒和星状病毒引起的鸭病毒性肝炎、番鸭“新肝病”和北京鸭“脾坏死病”等。自2010年以来，坦布苏病毒感染遍布我国蛋鸭主产区，导致产蛋下降及死亡。2015年，樱桃谷北京鸭感染鹅细小病毒发生了短喙和侏儒综合征。目前比较流行的鸭病毒性传染病的主要病原包括鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型、鸭星状病毒1型、鸭星状病毒2型、鸭呼肠孤病毒1型、鸭呼肠孤病毒2型、坦布苏病毒、禽流感病毒、鹅细小病毒和鸭肠炎病毒。这10种病毒包括RNA病毒和DNA病毒，对这10种病毒进行同时检测对于鸭病毒病的防控具有重要意义。针对致病病毒的常见诊断方法包括病毒培养、分子诊断方法和血清学检测等。其中，病毒培养方法包括在胚胎和细胞上分离病毒；分子诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR(mPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)等；血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)。在临床上，病毒分离耗时较长，且有些病毒例如鸭星状病毒的分离培养较困难；血清学检测一般是针对血清中特定病原的抗体进行检测，一般用于检测抗体水平；近年来，分子生物学技术得到了快速发展，PCR技术具有以其灵敏、快速和特异等特征得到了广泛应用。一般来讲，普通PCR技术一般只用于检测一种病毒，灵敏性一般可以检测到102～103拷贝；荧光定量PCR技术的灵敏度较高，可达到101～102拷贝，但由于荧光通道的限制，一般也只用于3种病原以下的同时检测。最近，还有研究者开发了一种基于毛细管电泳的鸭病毒检测的GeXP方法，虽然该方法所检测的病毒包括11种，但是并不包括近期比较流行的鹅细小病毒和鸭星状病毒等病毒，且该方法在11种病毒均存在的情况下灵敏度仅为103拷贝，并且在结果判断方面存在较大的人为误差。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种可同时检测十种鸭源病毒的检测试剂盒，利用该试剂盒进行鸭源病毒检测的。本专利技术的另一个目的在于提供一种利用上述试剂盒进行鸭源病毒检测的方法。为达到上述第一个目的，本专利技术采用下述技术方案：一组基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测引物和探针，包括：鸭甲肝病毒1型的PCR引物序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和质量探针SEQIDNo.23；鸭甲肝病毒3型的PCR引物序列SEQIDNo.3、SEQIDNo.4和质量探针SEQIDNo.24；鸭星状病毒1型的PCR引物序列SEQIDNo.5、SEQIDNo.6和质量探针SEQIDNo.25；鸭星状病毒2型的PCR引物序列SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和质量探针SEQIDNo.26；鸭呼肠孤病毒1型的PCR引物序列SEQIDNo.9、SEQIDNo.10和质量探针SEQIDNo.27；鸭呼肠孤病毒2型的PCR引物序列SEQIDNo.11、SEQIDNo.12和质量探针SEQIDNo.28；坦布苏病毒的PCR引物序列SEQIDNo.13、SEQIDNo.14和质量探针SEQIDNo.29；禽流感病毒的PCR引物序列SEQIDNo.15、SEQIDNo.16和质量探针SEQIDNo.30；小鹅瘟病毒的PCR引物序列SEQIDNo.17、SEQIDNo.18和质量探针SEQIDNo.31；鸭肠炎病毒的PCR引物序列SEQIDNo.19、SEQIDNo.20和质量探针SEQIDNo.32；内参基因β-actin的PCR引物序列SEQIDNo.21、SEQIDNo.22和质量探针SEQIDNo.33。优选地，所述鸭源病毒检测试剂盒包括如上所述的鸭源病毒检测引物和探针。优选地，PCR引物序列SEQIDNo.1-SEQIDNo.22的5’端修饰有如SEQIDNo.56所示的碱基序列。优选地，所述鸭源病毒检测试剂盒还包括进行反转录和PCR反应所需的试剂。为达到上述第二个目的，本专利技术采用下述技术方案：一种定点基因质谱法检测鸭源病毒多重PCR产物的方法，所述方法利用如上所述的试剂盒同时检测鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、鸭星状病毒1型(DAstV-1)、鸭星状病毒2型(DAstV-2)、鸭呼肠孤病毒1型(DRV-1)、鸭呼肠孤病毒2型(DRV-2)、坦布苏病毒(TMUV)、禽流感病毒(AIV)、小鹅瘟病毒(GPV)和鸭肠炎病毒(DEV)10种病毒和1种内参基因β-actin。优选地，所述方法至少包括以下步骤：利用多重PCR技术同时扩增待检样品中的十种鸭源病毒的目的基因和内参基因β-actin；将质量探针混合并对质量探针混合物进行特异的单个碱基延伸；利用质谱检测质量探针的单个碱基延伸产物，并对质谱检测结果进行分析。优选地，质谱检测采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)。优选地，对质谱检测结果进行分析时使用的是基因分型系统。优选地，质量探针混合物中各个质量探针的浓度分别为：6.80μM(β-actin)、6.00μM(AIV)、7.20μM(TMUV)、13.60μM(DHAV-1)、6.00μM(GPV)、10.00μM(DRV-1)、6.80μM(DAstV-2)、7.20μM(DAstV-1)、15.60μM(DRV-2)、12.00μM(DEV)、21.60μM(DHAV-3)。优选地，进行多重PCR扩增时，10种病毒和1种内参基因的22条PCR引物在反应体系中等摩尔混合。本专利技术的有益效果如下：为了克服现有检测方法灵敏度较低或者无法做到多重检测的缺点，本专利技术利用定点基因质谱检测技术，即利用核酸分型系统结合多重PCR技术、质量探针延伸技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术建立对特定位置的碱基进行检测的技术。多重PCR可以对多靶标进行扩增以扩大目的基因数量，利用质量探针延伸技术对特异的一个碱基进行延伸，利用MALDI-TOFMS对延伸后的质量探针进行质谱检测和分析，从而判断特定位点的碱基类型。本专利技术提供的检测试剂盒和检测方法具有以下主要的优点。高敏感性：本专利技术利用了多重PCR和质量探针延伸两轮扩增过程，将待检目标的量放大。同时，本专利技术使用的核酸分型系统是基于新一代宽谱定量飞行时间质谱平台，该平台是利用靶板和离子探测器同时接地专利技术，保证了在全靶板范围内的质量检测精度，还配备了新一代离子光学系统，实现在较大质量范围内高灵敏度检测，可使检测的灵敏度达到100～101拷贝。高特异性：本专利技术利用特异性质量探针识别已扩增的DNA片段，进行单个碱基的延长，和焦磷酸测序具有类似的原理，且只延伸一个碱基，错配率低，结果分析均为软件自动分析，不存在人为误差，特异性较好。低成本：本专利技术一次可同时检测10种病毒和1种内参基因，根据需要还可对检测对象进行扩增，大大降低了检测成本，可为今后的快速本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测引物和探针，其特征在于，包括：鸭甲肝病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和质量探针SEQ ID No.23；鸭甲肝病毒3型的PCR引物序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和质量探针SEQ ID No.24；鸭星状病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和质量探针SEQ ID No.25；鸭星状病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和质量探针SEQ ID No.26；鸭呼肠孤病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和质量探针SEQ ID No.27；鸭呼肠孤病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和质量探针SEQ ID No.28；坦布苏病毒的PCR引物序列SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和质量探针SEQ ID No.29；禽流感病毒的PCR引物序列SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和质量探针SEQ ID No.30；小鹅瘟病毒的PCR引物序列SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和质量探针SEQ ID No.31；鸭肠炎病毒的PCR引物序列SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和质量探针SEQ ID No.32；内参基因β‑actin的PCR引物序列SEQ ID No.21、SEQ ID No.22和质量探针SEQ ID No.33。...
【技术特征摘要】
1.一组基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测引物和探针，其特征在于，包括：鸭甲肝病毒1型的PCR引物序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和质量探针SEQIDNo.23；鸭甲肝病毒3型的PCR引物序列SEQIDNo.3、SEQIDNo.4和质量探针SEQIDNo.24；鸭星状病毒1型的PCR引物序列SEQIDNo.5、SEQIDNo.6和质量探针SEQIDNo.25；鸭星状病毒2型的PCR引物序列SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和质量探针SEQIDNo.26；鸭呼肠孤病毒1型的PCR引物序列SEQIDNo.9、SEQIDNo.10和质量探针SEQIDNo.27；鸭呼肠孤病毒2型的PCR引物序列SEQIDNo.11、SEQIDNo.12和质量探针SEQIDNo.28；坦布苏病毒的PCR引物序列SEQIDNo.13、SEQIDNo.14和质量探针SEQIDNo.29；禽流感病毒的PCR引物序列SEQIDNo.15、SEQIDNo.16和质量探针SEQIDNo.30；小鹅瘟病毒的PCR引物序列SEQIDNo.17、SEQIDNo.18和质量探针SEQIDNo.31；鸭肠炎病毒的PCR引物序列SEQIDNo.19、SEQIDNo.20和质量探针SEQIDNo.32；内参基因β-actin的PCR引物序列SEQIDNo.21、SEQIDNo.22和质量探针SEQIDNo.33。2.一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒，其特征在于，所述鸭源病毒检测试剂盒包括如权利要求1所述的鸭源病毒检测引物和探针。3.根据权利要求2所述的鸭源病毒检测试剂盒，其特征在于，PCR引物序列SEQIDNo.1-SEQIDNo.22的5’端修饰有如SEQIDNo.56所示的碱基序列。4.根据权利要求2所述的鸭源病毒检测试剂盒，其特征在于，所述鸭...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宁，周晓光，李运涛，佟雪梅，
申请(专利权)人：融智生物科技青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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