一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒三种病毒的遗传特征设计的特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT‑PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒。本发明专利技术的有益效果在于：本发明专利技术的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法实现了准确、快速、高效的进行三种病毒性疾病RT‑PCR鉴别和诊断。

A multiplex RT-PCR method for detection of bovine rotavirus, coronavirus and viral diarrhea virus

【技术实现步骤摘要】
一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法
本专利技术属于致病性病毒检测
，具体涉及一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法。
技术介绍
牛轮状病毒病是由轮状病毒引起的多种幼龄动物和婴幼儿的急性胃肠道传染病，以精神委顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征。本病病原为轮状病毒，病毒粒子呈圆形，似车轮状。病毒对外界因素的抵抗力较强，在粪便和不含抗体的乳汁中，经半年仍有感染性。患者及隐性感染者的粪便内含有大量的轮状病毒，并可经消化道传染给易感人畜。在人和各种动物间有一定交互感染作用，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。本病主要发生在犊牛，发病日龄主要为15～90天。春、秋两季发病较多。病毒存在于肠道，随粪便排出体外，经消化道感染。轮状病毒有交互感染的作用，可以从人或一种动物传给另一种动物，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒属。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80-120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，属于RNA病毒。冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60-200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒引起的传染病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。临床症状：发病时多数牛不表现临床症状，牛群中只见少数轻型病例。有时也引起全牛群突然发病。急性病牛，腹泻是特征性症状，可持续1～3周。粪便水样、恶臭，有大量粘液和气泡，体温升高达40～42℃。慢性病牛，出现间歇性腹泻，病程较长，一般2～5个月，表现消瘦、生长发育受阻，有的出现跛行。牛的轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻三种RNA病毒，在日常的养殖过程中，属于多发疾病，而且有着相似的临床症状，仅仅根据临床症状很难进行区分，为临床确诊和治疗带来了一定的难度，所以需要开发有效的检测方法。现有技术中最快速有效的检测方法为RT-PCR，使用的具体技术为FastKing一步法RT-PCR试剂盒，但是这种方法存在一定的缺陷，根据试剂盒说明书提供的RT-PCR体系中只加入一对特异性的引物进行一种特异性的检查。对于这三种病的鉴别诊断或被检样品数量大，检测项目多的时候就需要耗费大量试剂、耗材与时间，给后续的琼脂糖凝胶电泳实验也带来相应的困难。
技术实现思路
为了克服现有的常规RT-PCR的不足,本专利技术提供一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，该检测方法不仅能减少了试剂与耗材的消耗、节省了大量的时间，而且能方便地实现被检样品对于牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒三种病毒性疾病的快速鉴别和诊断。一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，以待检测样品的RNA为RNA模板，以牛轮状病毒(SEQIDNO.1，597bp)、牛冠状病毒(SEQIDNO.2，624bp)、牛病毒性腹泻病毒(SEQIDNO.3，504bp)三种病毒的遗传特征设计的特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT-PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒。作为一种优选的方案，所述检测方法采用的RT-PCR扩增体系为：25μL的2×FastKingOneStepRT-PCRMasterMix，2μL的25×RT-PCREnzymeMix，1.25μL的上游特异性引物，1.25μL的下游特异性引物，5.5μL的待测样品RNA模板，加RNase-FreeddH2O至50μL；更为优选的是，所述特异性上游引物为10μM的牛轮状病毒上游引物、牛冠状病毒上游引物、牛病毒性腹泻病毒上游引物三种上游引物组成的混合物，所述特异性下游引物为10μM的牛轮状病毒下游引物、牛冠状病毒下游引物、牛病毒性腹泻病毒下游引物三种下游引物组成的混合物；且所述牛冠状病毒上游引物序列为5′-ATGGCATCCTTAAGTGGGCCGA-3′,所述牛冠状病毒下游引物序列为5′-TTACACAGGTAGGGGTTCTATTGCC-3′；所述牛轮状病毒上游引物序列为5′-ATGTCTCAGTATTGACGTGACGAGTCT-3′，所述牛轮状病毒下游引物序列为5′-CTACAATCGATCAGTTGCATTGCG-3′；所述牛病毒性腹泻上游引物序列为5′-ATGGAGTTGATCACAAATGAACTTTTATACA-3′，所述牛病毒性腹泻下游引物序列为5′-GCAACTTGTGACCCATAGAGGGC-3′。更为优选的是，所述检测方法采用的RT-PCR扩增条件为：42℃30min，95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，45个循环；70℃5min，4℃保存备用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法具有以下优势：①本专利技术的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法将三个病毒可以通过加入到一个体系中，RNA模板会自行与所含有病毒引物结合进行扩增，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳经成像系统拍照，就能直观的看到检测结果，相比原来三个体系，更加节省了时间、试剂和耗材，极大节约了科研经费。②本专利技术的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法实现了快速诊断、结果准确的效果。③本专利技术的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法不是简单的将三种体系合为一个体系，而是要确保这三种引物可以准确的检测出疾病，而且要保证三种引物序列不能有相关性，避免形成稳定二聚体，每条引物之间不能有5个碱基以上的互补区。④本专利技术的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法实现了准确、快速、高效的进行三种病毒性疾病RT-PCR鉴别和诊断。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，现对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11.材料准备：(1)待检测样品：牛抗凝血8管，常规方法提取RNA备用；(2)特异性上游引物和特异性上游引物：特异性上游引物为10μM的牛轮状病毒上游引物、牛冠状病毒上游引物、牛病毒性腹泻病毒上游引物三种上游引物的混合物，特异性下游引物为10μM牛轮状病毒下游引物、牛冠状病毒下游引物、牛病毒性腹泻病毒下游引物三种下游引物的混合物；且牛冠状病毒上游引物序列为5′-ATGGCATCCTTAAGTGGGCCGA-3′,牛冠状病毒下游引物序列为5′-TTACACAGGTAGGGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以牛轮状病毒(SEQ ID NO.1，597bp)、牛冠状病毒(SEQ ID NO.2，624bp)、牛病毒性腹泻病毒(SEQ ID NO.3，504bp)三种病毒的遗传特征设计的特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT‑PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒。

【技术特征摘要】
1.一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以牛轮状病毒(SEQIDNO.1，597bp)、牛冠状病毒(SEQIDNO.2，624bp)、牛病毒性腹泻病毒(SEQIDNO.3，504bp)三种病毒的遗传特征设计的特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT-PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒。2.根据权利要求1所述的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法采用的RT-PCR扩增体系为：25μL的2×FastKingOneStepRT-PCRMasterMix，2μL的25×RT-PCREnzymeMix，1.25μL的上游特异性引物，1.25μL的下游特异性引物，5.5μL的待测样品RNA模板，加RNase-FreeddH2O至50μL。3.根据权利要求1所述的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，其特征在于，所述特异性上游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：史量全，刘锴，马德慧，郭双，殷杰，王永强，赵志炎，
申请(专利权)人：内蒙古民族大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15