用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV‑1病毒RNA的pol基因的第41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M的ARMS引物和Taqman探针。本发明专利技术还提供了上述引物对和探针在检测D4T和AZT主要耐药突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M中的应用。本发明专利技术试剂盒检测灵敏度高、特异性好、检测成本低，为临床艾滋病患者治疗提供了用药指导，实现了艾滋病患者个体化治疗，能够提高药物有效果性，改善患者的生存质量，具有广泛应用前景和社会效益。

Primer Pairs and Probes for Detecting Drug Resistance Mutations of D4T and AZT in AIDS Therapeutic Drugs and Their Applications

【技术实现步骤摘要】
用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针及其应用
本专利技术属于生物医药领域，特别涉及一种用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针及其应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HIV-1),属于逆转录病毒慢性病毒，是艾滋病的病原体。艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(AIDS),是一种由人类免疫缺陷病毒引起的，以全身免疫系统严重损伤为特征的传染性人体免疫系统疾病。临床表现为不常见的感染、恶性肿瘤以及不明原因的免疫缺陷综合症。HIV-1的病毒结构、生活周期及复制过程：HIV-1是RNA逆转录病毒，它的生活周期类似于RNA肿瘤病毒。病毒颗粒外包被磷脂双分子层包膜，内有圆柱状核心蛋白，有RNA逆转录酶、整合酶和结构蛋白等组成。有三个蛋白基因：gag基因编码核心蛋白、pol基因编码逆转录酶与整合酶、env基因编码包膜蛋白；6个非结构蛋白基因。HIV-1病毒颗粒从亲代到子代的复制过程，构成了它的生活周期，包括了病毒的衣服、侵入和脱壳、反转录、整合、病毒RNA和蛋白质的合成、装配、释放和成熟等阶段。首先HIV-1通过与宿主细胞上的受体结合，与宿主细胞膜融合后侵入靶细胞。一旦HIV-1外壳和靶细胞质膜相融合，病毒的核心蛋白就进入细胞。在HIV-1的核心蛋白中包埋着RNA基因组合逆转录酶。病毒的RNA基因组复制需要经过DNA中间产物，后在逆转录酶的作用下将病毒RNA基因组转变成双链DNA，再整合进入宿主细胞的染色体中，最后以原病毒的形式成为宿主基因组的永久成分，并在宿主细胞分裂时随宿主DNA的复制而复制。科学家发现了的HIV-1的治疗药物司他夫定(D4T)和齐多夫定(AZT)是目前常用的两种HIV-1核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTIs),但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。过去的研究一证明可引起D4T和AZT耐药产生的突变是pol结构基因M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M六中突变。目前应用于检测HIV-1耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。然而该方法却存在着检测周期长、灵敏度低、非闭管操作、易造成交叉污染、杂合突变等等缺陷，使得很难适应于临床检测。因此，开发出一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的HIV-1耐药突变检测方法是对临床检测HIV-1耐药检测具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本专利技术提供了一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，还提供了一种包括上述引物对和探针的检测试剂盒以及使用方法。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案，如下：本专利技术提供了一种艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M的ARMS引物和Taqman探针。M41L的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；D67N的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；K70R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；L210W的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.6和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；T215Y的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；Q151M的AARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；本专利技术还提供了一种用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点中的试剂盒，包括权利要求上述ARMS引物对和探针。优选地，所述试剂盒还包括RT-PCR混合液、混合酶液、阳性对照品混合液、阴性对照品混合液；所述RT-PCR混合液包括：RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、6对上下游引物及2条探针；所述混合酶液包括：M-MLV逆转录酶和TapDNA聚合酶。更优选地，所述试剂盒中各组分含量分别为：更优选地，所述试剂盒中：RT-PCR混合液包括RT-PCR缓冲液(20mMTris-HCl,50mMKClpH8.3)终浓度1×；dNTPs终浓度2mM；MgCl2终浓度2mM；ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM；各ARMS上下游引物以及试剂盒质控品上下游引物所对应的Taqman探针终浓度为175nM；MLV逆转录酶终浓度1.6U/μL；TaqDNA聚合酶终浓度0.05U/μL；阳性对照混合液中模板cDNA终浓度0.1～10ng/μL；本专利技术还提供了上述试剂盒在检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点中的应用，包括以下步骤:总RNA提取：提取待测样本的RNA，提到模板RNA溶液；反应组分配制：分别配制检测混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物；其中，检测混合物按PCR混合液14uL、混合酶液2.5uL、引物探针3.5uL、模板RNA溶液5uL配制一人份；阳性对照品混合物按PCR混合液14uL、混合酶液2.5uL、引物探针3.5uL、阳性对照品混合液5uL配制一人份；阴性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、引物探针3.5uL、阴性对照品混合液5uL配制一人份；扩增：分别将检测混合物、阳性质控品混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物放入荧光定量PCR仪扩增，反应条件为42℃逆转录10min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；95℃变形10s，55℃退火并延伸30s，40个扩增循环。结果判定：根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct值判定结果：当阳性质控品和阳性对照品的Ct值小于等于35，或者检测混合物为阳性时，试剂盒有效；当阳性质控品或阳性对照品的Ct值大于35，或者检测混合物无Ct值时，试剂盒无效或需重复检测。其中，根据检测混合物的Ct值定性判定，依据为：Ct＞40时，待测样本中无HIV-1治疗药物D4T和AZT耐药突变；35≤Ct≤40时，待测样本可疑，需重检一次，重检结果如Ct＞40或无扩增曲线，则为待测样本中无HIV-1治疗药物D4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV‑1病毒RNA的pol基因的41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；M41L的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；D67N的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；K70R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；L210W的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.6和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；T215Y的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。...

【技术特征摘要】
1.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的41位、67位、70位、210位、215位和151位突变位点M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；M41L的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；D67N的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；K70R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；L210W的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.6和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；T215Y的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.7和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。2.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第41位突变位点M41L的ARMS引物和Taqman探针；M41L的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。3.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第67位突变位点D67N的ARMS引物和Taqman探针；D67N的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。4.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第70位突变位点K70R的ARMS引物和Taqman探针；K70R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。5.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第210位突变位点L210W的ARMS引物和Taqman探针；L210W的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.6和SEQIDNo.9所示的核苷酸序列；ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。6.用于检测艾滋病治疗药物D4T和AZT耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第215位突变位点T215Y的ARMS引物和Taqman探针；T215Y的A...

【专利技术属性】
技术研发人员：武建，张军，
申请(专利权)人：江苏发士达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32