一种呼吸道病毒的检测方法技术

本发明专利技术提供一种高效快速富集呼吸道病毒的高通量检测方法。高效快速富集呼吸道病毒的高通量检测鉴定技术包括以下四个部分：呼吸道样本病毒的富集、建库、高通量测序及生物信息分析。呼吸道样本病毒富集是本技术的核心部分，首先用生物物理的方法去除样本中除病毒以外的宿主的核酸，然后提取样本病毒核酸。借助于Agilent 2100仪器的检测只用200pg的核酸用于建库，高能量测序和生物信息学分析的结果显示病毒的reads数从常规方法处理不到0.1％升高到84％以上，这种检测技术不仅可以快速检测样本感染病毒，而且提高病毒的全基因组序列的覆盖率(95‑100％以上)，大幅度的降低测序成本。

A Method for Detecting Respiratory Virus

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸道病毒的检测方法
：本专利技术涉及生物
，涉及一种呼吸道病毒的检测方法。
技术介绍
：病毒能引起的人类疾病种类繁多。呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染。上呼吸道感染是指自鼻腔至喉部之间的急性炎症的总称，是最常见的感染性疾病。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的治疗方法。上呼吸道感染90％左右由病毒引起，细菌感染常继发于病毒感染之后。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播。常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌，迅速生长繁殖，导致感染。常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。无论是下呼吸道感染还是上呼吸道感染，绝大部分是由病毒引起的，称为病毒性呼吸道感染。呼吸道病毒包括DNA和RNA病毒，在细胞水平上，病毒主要的破坏作用是导致细胞裂解，从而引起细胞死亡，一旦机体内有足够多的细胞死亡，就会对呼吸道病毒感染的症状。临床上常常通过PCR或RT-PCR定量或定性分析病毒核酸确证呼吸道病毒感染的种类，但需要序列特异性的引物才能进行PCR病毒核酸的检测，也有一些常规的流感病毒检测试剂盒，但漏检率高，所以临床治疗方面，常常以抗生素为主，这样导致抗生素的滥用。另外由于病毒的变异特别的快，特别是在特异性引物的TaqDNA聚合酶作用下PCR反应时，对于低copy样本产生病毒漏检，因此PCR并不适合临床常规呼吸道病毒检测，多数以科研为目的。随着人类基因组工程的完成,对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术(nextgenerationsequence,NGS)的发展。NGS新的测序平台允许进行高通量测序,具有广泛的应用,特别是对于病毒组学的研究更具有意义。NGS非特异性的引物PCR,对于检测出的大量病毒copy片段可以解决病毒的高变异特性和低copy检测率，更可以解决未知病原体包括病毒的检测。NGS病毒(DNA病毒或RNA病毒要反转录的cDNA)测序的主要包括以下流程:1.病毒样本制备；2.文库构建和验证：DNA碎片化现多采用酶消化法，该方法需要的样本量低，本研究只用200pmol酶消化的方法，快速并且容易，减少样本处理时间和污染的机会；3.高通量测序；Miseq或Hiseq，或三代测序4.生物信息学分析。但在呼吸道病毒二代测序中也存在如下问题，而且对于所有的病毒二代测序都存在同样的问题。那就是二代测序过程中，为了增加病毒核酸的覆盖率，只有增加测序深度，即增加每个样品的测序数据量，这样的结果会产生大量的reads(测序片段)和基因信息，Hiseq测序可以达到200G的数据量，Miseq测序也可以达到15G的数据量，但在生物信息分析这些数据时，常规方法处理样本产生的数据，发现99％以上的为宿主的基因序列，特别是低copy的病毒样本，病毒reads数不足0.01％，这样就导致二代测序成本的直接升高，不利于临床样本呼吸道病毒二代测序的应用，另外海量的数据分析不仅增加了检测成本而且消耗了大量的时间和服务器的空间。为了解决这一问题，许多科研工作者通过超速离心的方法富集病毒，虽然病毒的通量有一定的提高，但是超高速离心至少需要六个小时，每次离心样品的数量限于6个，且对仪器要求和操作技术要求很高，因此这种方法并不适用于高通量大量临床样品的NGS检测。本专利技术要解决的问题就是用物理和生物学的方法而不是超高速离心的方法，快速富集样品病毒，在提取样本病毒核酸和建库之前，去除样本中除病毒颗粒以外的宿主的核酸的一种方法，在建库中，也做了很大的改进，200pg级的核酸量的酶解建库，和非模板依赖性的PCR随机扩增，在分析时也建立了本地化的呼吸道数据库，使生物信息学分析能在一个小时内完成。这样不仅节约了实验消耗成本，也节省了时间成本，为高通量临床测序应用提供了可能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种呼吸道病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的。本专利技术所要解决的关键问题就是用综合物理和生物学的方法快速富集样品病毒，样本病毒核酸提取和建库之前，去除样本中除病毒以外的宿主的核酸的一种方法。该方法可以使病毒的reads数从不到0.1％升高到84％以上，不仅可以快速检测病毒，而且可以得到病毒的全基因组序列，大幅度的降低测序成本。本专利技术所述的检测方法，包括呼吸道样本病毒富集和核酸提取、高通量测序文库构建和验证、高通量测序、生物信息学分析等四个步骤。其中，(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：基于呼吸道待检测样本富集、提取病毒核酸；其中，(2)高通量测序文库构建和验证：用酶切方法构建可用于高通量测序的核酸库；其中，(3)高通量测序：设定辅助基于宏基因组学技术的病毒感染检测的内参、对照；其中，(4)生物信息学分析：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成，包括远缘未知的病毒组成。(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：针对呼吸道样本微量(≤1ml)、痕量(≤1ul)待检测样本，本专利技术采用了一套呼吸道样本病毒富集方法，利用生物学和物理学的方法先富集样品病毒，再用酶消化的方法去除宿主游离的核酸，再提取病毒核酸的方法。具体地，步骤(1)所述呼吸道样本病毒富集和制备部分包括以下九个步骤：样本取样，样本细胞裂解和离心，样本浓缩、样本宿主游离核酸去除、样本宿主细胞核酸去除、提取病毒核酸DNA或RNA、逆转录合成互补cDNA(complementaryDNA)、非序列依赖性扩增、核酸纯化。第一步，样本取样：包括人和动物呼吸道样本，新鲜样品或-80℃冻存样品。如果是痕量的鼻咽试子，先保存于病毒采集管中，震荡30s，进行第二步处理或1小时之内-80℃冻存，其它鼻咽分泌物抽提物，肺泡灌洗液，痰液等需要加液化剂，进行第二步处理或1小时之内-80℃冻存，第二步，样本细胞裂解和离心：取上述病毒采集管样本50-500ul加无RNA酶的纯水，低渗裂解细胞，离心，取上清，第三步，样本浓缩：取上步上清液离心浓缩，得到浓缩样品，第四步，样本宿主游离核酸去除：上述浓缩样品用DNA和RNA磁珠吸附去除宿主游离核酸。第五步，样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸。第六步，提取病毒核酸DNA或RNA:主要提取DNA或RNA病毒的核酸包括的DNA或RNA。第七步，逆转录合成cDNA：将第六步提取出来的病毒RNA转化成更稳定更易保存的cDNA。第八步，非序列依赖性扩增：基于聚合酶链反应(PCR)将第七步获得的cDNA进行用非序列依赖性引物进行少许扩增，直到满足下一步高通量测序样本建库所要求的上样量1pg。这一步可选，如果第七步cDNA够的话，这一步可省略。第九步，病毒核酸纯化：纯化第七步或第八步获得的病毒核酸用于后续的测序前的文库构建和验证准备。二、高通量测序文库构建和验证其中，高通量测序文库构建和验证，指上步纯化的病毒核酸酶解片段化和加标签，构建300-700bp的文库，纯化并用Angilent2100核酸电泳验证。具体地，包括上步纯化的病毒核酸准确定量和稀释，用Nextera酶解法使核酸片段化和加接头过程在一个管子里面一步完成，纯化和鉴定。第一步，纯化的病毒核酸准确定量：用Qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种呼吸道病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：基于呼吸道待检测样本富集、提取病毒核酸；(2)高通量测序文库构建和验证：用酶切方法构建可用于高通量测序的核酸库；(3)高通量测序：设定辅助基于宏基因组学技术的病毒感染检测的内参、对照；(4)生物信息学分析：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成。

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：基于呼吸道待检测样本富集、提取病毒核酸；(2)高通量测序文库构建和验证：用酶切方法构建可用于高通量测序的核酸库；(3)高通量测序：设定辅助基于宏基因组学技术的病毒感染检测的内参、对照；(4)生物信息学分析：从高通量测序数据中准确分析样本中的物种组成。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述呼吸道样本病毒富集和核酸提取：包括以下九个步骤：样本取样，样本细胞裂解和离心，样本浓缩、样本宿主游离核酸去除、样本宿主细胞核酸去除、提取病毒核酸DNA或RNA、逆转录合成互补cDNA、非序列依赖性扩增、核酸纯化。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述呼吸道样本病毒富集和核酸提取：第一步，样本取样：人或动物呼吸道样本，新鲜样品或-80℃冻存样品，第二步，样本细胞裂解和离心：取上述病毒采集管样本50-500ul加无RNA酶的纯水，低渗裂解细胞，离心，取上清液，第三步，样本浓缩：取上步上清液离心浓缩，得到浓缩样品，第四步，样本宿主游离核酸去除：上述浓缩样品用DNA和RNA磁珠吸附去除宿主游离核酸，第五步，样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸，第六步，提取病毒核酸DNA或RNA：主要提取DNA或RNA病毒的核酸包括的DNA或RNA，第七步，逆转录合成cDNA：将上步提取出来的病毒RNA转化成更稳定更易保存的cDNA，第八步，非序列依赖性扩增：基于聚合酶链反应(PCR)将上步获得的cDNA进行用非序列依赖性引物进行少许扩增，直到满足下一步高通量测序样本建库所要求的上样量1pg，第九步，病毒核酸纯化：纯化第七步或第八步获得的病毒核酸用于后续的测序前的文库构建和验证准备。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(2)高通量测序文库构建和验证：第一步，纯化的病毒核酸准确定量：用Qubit方法对步骤(1)纯化的病毒核酸进行定量，并稀释到200pg/ul的核酸浓度，第二步，Nextera酶解法使核酸片段化和加接头：取上述第一步稀释到200pg/ul的核酸1ul加Nextera酶使核酸片段化和加接头，第三步，带标签的片段化核酸纯化：上述带标签的片段化核酸纯化构建文库，第四步，构建文库的验证：上述纯化的文库用Angilent2100电泳进行验证，使文库在300-700bp之间。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(3)高通量测序：高通量测序、将图像测序信号转换为核酸序列信息。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，(3)高通量测序：根据病毒检测长度的需求，可选择二代测序或三代测序，a、进行二代测序选步骤(2)片段化文库直接进行测序，b、进行三代测序，可直接用步骤(1)样本直接进行三代测序。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(1)呼吸道样本病毒富集和核酸提取：1.样本取样：首先从住院病人分别诊断为慢阻肺病人(cya)和过敏病人(cyb)，肺出血病人(cyc)及肺癌病人(cyd)取咽试子快速保存在病毒采集管中(约3ml)，震荡30s。2.样本细胞裂解和离心：取样本cya1和cyb1各400ul，15000rpm，4℃，离心10min，取上清到另一1.5ml的EP管中，沉淀中加500ul无RNA酶的纯水，15000rpm，4℃，离心10min，取上清与第一次上清合并，3.样本浓缩：取上清约800-850ul，用0.22μm滤膜过滤至洁净EP管中，再加入到2ml超滤管中，4000g，4℃，离心10min，离心浓缩样品约40-50ul，4.样本宿主游离核酸去除：上述40-50ul浓缩样品管中加入DNAcleanXP和RNAcleanXP磁珠各50ul，冰上5min，用磁力架吸弃磁珠，取上清114ul，5.样本宿主细胞核酸去除：用酶消化的方法去除宿主细胞核酸然后在37℃，消化30min，其中，TurboDnase是一种名为Turbo的脱氧核糖核酸酶；Nuclease是核酸酶；RNaseone是核糖核酸酶；TurboDNaseBuffer是Turbo脱氧核糖核酸酶的缓冲液，6.提取病毒核酸DNA或RNA:用QIAGEN公司的QIampviralRNAminiKit提取DNA或RNA病毒的核酸包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，杨帆，金奇，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11