多肽注射系统及其用途技术方案

本公开提供了用于将多肽注射到细胞中的信号肽、融合蛋白、多肽系统，及其在将多肽注射到细胞中的用途。到细胞中的用途。

【技术实现步骤摘要】
多肽注射系统及其用途


[0001]本专利技术涉及用于将多肽注射到细胞中的多肽注射系统及其用途。

技术介绍

[0002]自然界中的微生物在进化的过程中获得了多种多样的分子机制，使其在 复杂的生物环境中得以生存。其中，可伸缩注射系统(Contractile injectionsystems，CISs)便是微生物适应环境生存竞争的“武器”之一。该系统是大型 的蛋白复合体，可以将多种效应分子装载至复合体中并帮助微生物将这些效 应分子注射到细胞中，使微生物获得生存优势。CISs在自然界中广泛存在， 最典型的CISs如T4、P2和Mu噬菌体的可伸缩尾部，其结构、装配和作用机制 已经得到了研究。除噬菌体的尾部，细菌中也存在多种CISs以调节与宿主的 相互作用并抵御外敌，例如细菌的VI型分泌系统(Type VI Secretion System， T6SS)(S.Wettstadt,A.Filloux,Manipulating the type VI secretion system spiketo shuttle 378passenger proteins.PLoS One 15,(2020)；E.Del Tordello,O. Danilchanka,A.J.McCluskey,J.J.Mekalanos,Type VI secretion system sheathsas nanoparticles for antigen display.P Natl Acad Sci USA 113,3042
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3047)。T6SS 的组分和结构都与T4噬菌体的尾部高度相似，横跨细菌的内膜和外膜，能够 针对不同的对象转运多种效应分子(毒力因子)来达到产生毒性的作用。
[0003]在细菌和古细菌中，还发现有一种细胞外可伸缩注射系统(ExtracellularContractile injection systems，eCISs)。eCISs自身可被释放至细菌或古细菌外， 并将装载在其中的效应分子注射到靶细胞中发挥作用。已知的eCISs有发光 杆菌属(Photorhabdus spp.)中的毒力装置PVC(Photorhabdus virulence cassette) (G.Yang,A.J.Dowling,U.Gerike,R.H.ffrench
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Constant,and N.R.Waterfield, Photorhabdus virulence cassettes confer injectable insecticidal activity against thewax moth.J Bacteriol,2006.188(6):p.2254
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61.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)所分泌的R
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绿脓杆菌素(R
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type pyocin)(P.Ge,D.Scholl,P.G. Leiman,X.Yu,J.F.Miller,and Z.H.Zhou,Atomic structures of a bactericidalcontractile nanotube in its pre
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and postcontraction states.Nat Struct Mol Biol, 2015.22(5):p.377
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82.)、沙雷氏菌(Serratia entomophila)中的AFP(Serratiaantifeeding prophage)(J.B.Heymann,J.D.Bartho,D.Rybakova,H.P. Venugopal,D.C.Winkler,A.Sen,M.R.Hurst,and A.K.Mitra,Three
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dimensional structure of the toxin
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delivery particle antifeeding prophage ofSerratia entomophila.J Biol Chem,2013.288(35):p.25276
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84.)、藤黄紫假交替 单胞菌(Pseudoalteromonas luteoviolacea)中与个体变态发育相关的可伸缩装 置MAC(Metamorphosis
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associated contractile structure)(N.J.Shikuma,M. Pilhofer,G.L.Weiss,M.G.Hadfield,G.J.Jensen,and D.K.Newman,Marinetubeworm metamorphosis induced by arrays of bacterial phage tail
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like structures. Science,2014.343(6170):p.529
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33.)等。
[0004]蛋白质类药物因具有较高的特异性和较低的毒性，在疾病治疗领域具有 独特的治疗潜力。然而，由于大分子蛋白质与小分子药物相比难以透过细胞 膜进入细胞质内，目前大多数基于蛋白质类药物的治疗集中于靶向细胞外的 靶点，这极大地限制了蛋白质类药物在疾病治疗中的应用。因此，需要开发 有效地向细胞内递送蛋白质的方法，以扩大蛋白质类药物的应用范围。
[0005]目前，本领域已开发出一些将蛋白质递送至细胞内的方法。借助物理原 理开发的电穿孔法、显微注射法等，能够将蛋白质递送至胞内。但这些方法 需要特殊的装置在细胞膜上造成穿孔，不适合在临床中应用。用细胞穿透肽 或其他脂质对蛋白质类药物进行修饰，能够提高蛋白质的膜穿透性，但其制 备过程及后续的纯化过程繁琐，不利于大规模生产。目前，应用较为广泛的 蛋白质胞内递送方法是利用纳米载体包被蛋白质类药物，通过细胞的内吞作 用将蛋白质递送至胞内。然而，进入胞内的蛋白质被截留在内体中，最终大 多数的蛋白质类药物被内体中的蛋白酶降解，无法释放至细胞质发挥功能， 严重限制了该蛋白质递送方法的效力。

技术实现思路

[0006]专利技术人发现了信号肽，其位于非共生发光杆菌ATCC43949的PVC
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I、 PVC
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II、PVC
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IV或PVC
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V基因簇下游的效应因子序列的N末端。当与待被注 射到细胞中的多肽融合时，该信号肽能够稳定待被注射的多肽，并且能够引 导待被注射的多肽以将待被注射的多肽装载到PVC装置中。通过将该信号肽 融合到待被注射的多肽的N末端，形成的融合蛋白可以被PVC复合物识别并 且切除信号肽，进而将待被注射的多肽装载到PVC鞘管内腔中，从而形成多 肽注射系统，该多肽注射系统进而将该多肽注射到细胞内。
[0007]令人意外的是，专利技术人发现，与对于待被注射到细胞中的多肽具有严格 限制的其他纳米注射系统不同，该PVC复合物能够装载大范围的多肽，而不 考虑它本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种信号肽，其指导多肽装载到发光杆菌毒力盒(PVC)中，其中所述信号肽衍生自非共生发光杆菌(Photorhabdus asymbiotica)的PVC基因簇下游的效应因子。2.根据权利要求1所述的信号肽，其中所述非共生发光杆菌为非共生发光杆菌(Photorhabdus asymbiotica)ATCC43949。3.根据权利要求1或2所述的信号肽，其中所述信号肽衍生自所述PVC基因簇下游的效应因子的N末端40
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70个氨基酸，例如N末端50
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70个氨基酸、例如N末端45
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55个氨基酸、或N末端48
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52个氨基酸，优选N末端50个氨基酸的序列。4.一种信号肽，其中所述信号肽包含与选自SEQ ID NO:3、7、11、15、19、23或27的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列，或者所述信号肽包含与选自SEQ ID NO:3、7、11、15、19、23或27的氨基酸序列相比具有1
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5个氨基酸取代的氨基酸序列。5.一种核酸，其编码根据权利要求1
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4中任一项所述的信号肽。6.一种融合蛋白，其包含多肽和根据权利要求1
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4中任一项所述的信号肽，其中所述信号肽与所述多肽的N末端融合。7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述信号肽与所述多肽直接连接或通过接头连接。8.根据权利要求6或7所述的融合蛋白，其中所述多肽的分子量为10kDa至200kDa。9.根据权利要求6
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8中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽的等电点为4
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10。10.根据权利要求6
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9中任一项所述的融合蛋白，其中所述多肽选自信号通路调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白、激素或激素调节分子、细胞毒素、抗原或免疫原、标签蛋白或报告蛋白、抗菌肽、参与细胞代谢的酶和基因编辑蛋白。11.一种核酸，其包含编码根据权利要求6
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10中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体还包含编码非共生发光杆菌的发光杆菌毒力盒V(PVC
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V)结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：江峰，金奇，王霞，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：