【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸可视化检测，尤其涉及一种基于raa-lf技术的检测猴痘病毒的引物探针组合物及其用途。
技术介绍
1、痘病毒(poxvirus)是一类有包膜的基因组较大的线型双链dna病毒，包括痘苗病毒(vaccinia virus)、天花病毒(variola virus)、牛痘病毒(cowpox virus)和猴痘病毒(monkeypox virus)等。痘病毒拥有大量基因组，在不同种属间130～375kbp的序列中包含多达328个开放阅读框(open reading frames,orfs)。
2、痘病毒作为一类广泛存在的病原，多数成员能够感染人和多种动物且能引起死亡，并且可以通过密切接触皮肤损伤、体液、呼吸道飞沫和被褥等受污染物体在人与人之间传播。在19世纪至20世纪，利用痘苗病毒作为疫苗进行大规模接种预防天花，在消除天花的过程中起到至关重要的作用。
3、天花消灭后，其他动物源性痘病毒如猴痘病毒的感染陆续被发现。猴痘感染后潜伏期长，一般为10-14天，临床表现主要为起疹、发热、淋巴结肿大等。这些特征表明，此轮猴痘病毒的传播具有隐匿性，具有较高的人传人风险，阻断猴痘病毒感染更具有挑战性。
4、考虑到猴痘病毒有较强的感染与传播能力，如何实现对其快速准确的诊断，从而对感染病患实现有效的隔离防治，保障公共卫生安全是目前最为重要紧迫的事情。因此，加强猴痘病毒的监测，增强现有监测手段是防控猴痘流行的重要手段之一。
5、因此，一种针对猴痘病毒的灵敏度高、特异性强、操作简单快速的检测方法亟需
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的是提出一种基于raa-lf技术的检测猴痘病毒的引物探针组合物及其用途，采用该引物探针组合物以raa-lf技术检测猴痘病毒，具有灵敏度高、特异性强、操作简单快速的特点。
2、基于上述目的，本专利技术的第一个方面提供了一种引物探针组合物，其包含：
3、针对n3r基因的引物对和探针；和/或
4、针对n4r基因的引物对和探针；
5、其中，针对n3r基因的引物对和探针包括：核苷酸序列如seq id no:11所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no:12所示的下游引物，核苷酸序列如seq id no:13所示的探针；
6、针对n4r基因的引物对和探针包括：核苷酸序列如seq id no:14所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no:15所示的下游引物，核苷酸序列如seq id no:16所示的探针。
7、在本专利技术的优选的实施方案中，上述引物探针组合物还包含：
8、针对d6r基因的引物对和探针；和/或
9、针对e9l基因的引物对和探针；
10、其中，针对d6r基因的引物对和探针包括：核苷酸序列如seq id no:3所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no:4所示的下游引物，核苷酸序列如seq id no:5所示的探针；
11、针对e9l基因的引物对和探针包括：核苷酸序列如seq id no:6所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no:7所示的下游引物，核苷酸序列如seq id no:8所示的探针。
12、在本专利技术的优选的实施方案中，seq id no:12、seq id no:15、seq id no:4或seqid no:7所示的下游引物的5’端标记有生物素，
13、seq id no:13、seq id no:16、seq id no:5或seq id no:8所示的探针的5’端标记有荧光素，中间位置处的任一个碱基被四氢呋喃残基取代，3’端连接有封闭基团。
14、在本专利技术的优选的实施方案中，所述荧光素为异硫氰酸荧光素(fitc)，所述封闭基团为c3-spacer(聚合物延伸阻断物)，距离探针的5’端的第31位碱基被四氢呋喃(thf)残基取代。
15、本专利技术的第二个方面提供了一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其包含上述引物探针组合物。
16、在本专利技术的优选的实施方案中，上述试剂盒还包含核酸释放剂；
17、优选地，所述核酸释放剂包含阴离子表面活性剂0.05～0.2mm/l，氯化钾50mm/l～200mm/l，十二烷基磺酸钠0.05％～0.2％和乙醇0.05～0.3％；
18、更优选地，所述核酸释放剂包含阴离子表面活性剂0.1mm/l，氯化钾100mm/l，十二烷基磺酸钠0.1％和乙醇0.1％。
19、在本专利技术的优选的实施方案中，上述试剂盒还包含raa-lf扩增试剂盒和胶体金免疫层析试纸条；
20、优选地，所述raa-lf试剂盒包括含有冻干酶粉的反应管、水解缓冲液、醋酸镁和ddh2o。
21、在本专利技术的优选的实施方案中，上述试剂盒还包含阳性对照；
22、优选地，所述阳性对照分别为puc57-d6r、puc57-e9l、puc57-n3r或puc57-n4r质粒；
23、其中，puc57-d6r质粒含有核苷酸序列如seq id no:1所示的d6r基因，puc57-e9l质粒含有核苷酸序列如seq id no:2所示的e9l基因，puc57-n3r质粒含有核苷酸序列如seqid no:9所示的n3r基因，和puc57-n4r质粒含有核苷酸序列如seq id no:10所示的n4r基因。
24、本专利技术的第三个方面提供了上述引物组合物或上述试剂盒在开发和/或制备检测和/或诊断猴痘病毒产品中的用途。
25、本专利技术的第四个方面提供了一种检测猴痘病毒的非诊断方法，其包括以下步骤：
26、(1)提取待测样品中的dna；
27、(2)将上述引物组合物和步骤(1)获取的待测样品的dna配制得到raa-lf反应体系，进行raa扩增，得到扩增产物；
28、(3)将扩增产物加到胶体金免疫层析试纸条进行检测，并进行结果判读。
29、在本专利技术的优选的实施方案中，若质控线和检测线位置均出现条带则扩增产物为阳性；若质控线位置出现条带，而检测线位置无条带则扩增产物为阴性；若质控线位置没有出现条带，则检测效果无效。
30、在本专利技术的优选的实施方案中，若采用针对n3r基因的引物对和探针和/或针对n4r基因的引物对和探针检测结果为阳性时，则待测样品含有猴痘病毒的dna；
31、若采用针对d6r基因的引物对和探针和/或针对e9l基因的引物对和探针检测结果为阳性时，则待测样品含有正痘病毒的dna；
32、若采用针对d6r基因的引物对和探针和/或针对e9l基因的引物对和探针检测结果为阳性时，针对n3r基因的引物对和探针和/或针对n4r基因的引物对和探针检测结果为阴性时，则待测样品含有除猴痘病毒以外的其他正痘病毒的dna。
33、在本专利技术的优选的实施方案中，在步骤(1)中，将采样拭子与核酸释放剂混合来提取待测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物探针组合物，其包含：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其中，还包含：
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其中，SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQID NO:4或SEQ ID NO:7所示的下游引物的5’端标记有生物素，
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其中，所述荧光素为异硫氰酸荧光素，所述封闭基团为C3-Spacer，距离探针的5’端的第31位碱基被四氢呋喃残基取代。
5.一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，还包含核酸释放剂；
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，还包含RAA-LF扩增试剂盒和胶体金免疫层析试纸条；
8.根据权利要求5-7中任一项所述的试剂盒，其中，还包含阳性对照；
9.权利要求1-4中任一项所述的引物组合物或权利要求5-8中任一项所述的试剂盒在开发和/或制备检测和/或诊断猴痘病毒产品中的用途。
10.一种检
11.根据权利要求10所述的方法，其中，
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，
13.根据权利要求10-12任一项所述的方法，其中，在步骤(1)中，将采样拭子与核酸释放剂混合来提取待测样品中的DNA；
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中，所述RAA扩增的条件为：恒温39±1℃反应10-30min；
...【技术特征摘要】
1.一种引物探针组合物，其包含：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其中，还包含：
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其中，seq id no:12、seq id no:15、seqid no:4或seq id no:7所示的下游引物的5’端标记有生物素，
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其中，所述荧光素为异硫氰酸荧光素，所述封闭基团为c3-spacer，距离探针的5’端的第31位碱基被四氢呋喃残基取代。
5.一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，还包含核酸释放剂；
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中，还包含raa-...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭斐，赵斐，许丰雯，梅珊，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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