一种非洲猪瘟病毒LAMP-HNB可视化检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP‑HNB可视化检测试剂盒，使用非洲猪瘟病毒P72基因作为LAMP检测的引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒基因P72，可以有效检出ASFV。所述LAMP检测方法可以实现非洲猪瘟病毒的快速检测，检测结果可以直接目测，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖，且所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快。另外本发明专利技术采用了可视化检测手段，当样品颜色由紫罗兰色变为天蓝色则说明其为阳性，只需要观察反应产物的颜色即可实现样品检测结果的判断，简单易学，适合临床和基层检测。

A Visual Detection Kit for African Swine Fever Virus LAMP-HNB

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒LAMP-HNB可视化检测试剂盒
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP-HNB可视化检测试剂盒。
技术介绍
：非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病时间短，病死率高。ASF是对养猪业危害最为严重的疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病。ASFV属于双链DNA病毒目非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，该属目前仅有一个ASFV病毒种。ASFV的基因组为单分子线状DNA，长度约170～190kb。ASFV个体较大，直径可达200nm，表面为二十面体结构和一层含类脂的囊膜，因此高温和一些破坏囊膜的消毒剂均可有效杀灭ASFV。但是由于其复杂的分子结构，ASFV对消毒剂的抵抗力较其他的囊膜病毒稍强，特别是在一些猪肉制品或血液中存活时间更长。据报道，ASFV在在血液、粪便和组织中存活时间长达半年，在生肉或者未完全煮熟的猪肉制品中存活时间长达3个月，这就导致ASFV一旦传入，往往在疫源地长期存在，造成二次或次级感染。非洲猪瘟的发病率和病死率均可达到100％，且目前世界范围内尚无有效疫苗问世，其扩散和流行对养猪产业可能造成毁灭性打击，由此产生的间接损失则无法估量。现有的实验室检测方法主要有血清学方法和病原学方法。血清学方法主要有间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验等，其中酶联免疫吸附试验已经有商品化的试剂盒出售。ASFV的病原学方法也有很多，如病毒的细胞培养和分离、直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA法、普通PCR和荧光PCR方法等，其中OIE推荐的普通PCR和荧光PCR方法最为常用。我国《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》中提到了3种ASFV病原学检测方法：双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应(OIE官方网站)。除此以外，还要加大ASF防控技术研制工作力度，尽快开发简易、高效、特异的诊断试剂和诊断方法，并能够与古典猪瘟、高致病性猪蓝耳病等其他猪群疫病相鉴别。环介导等温扩增法(Loopmediatedisothermalamplificationmethod,LAMP)是一种新兴的核酸扩增技术，它采用独特的引物设计实现等温条件下的核酸快速扩增。在现有期刊文献中也出现了多篇LAMP检测非洲猪瘟的文章，例如江彦增等①、杨吉飞等②、王彩霞等③、王华等④均建立了非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法，然而，市场上并未出现相关的产品。为了将LAMP技术运用到ASFV的检测和产品中，应对2018年在我国发现的非洲猪瘟疫情，本研究使用非洲猪瘟病毒P72基因作为LAMP检测的引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒基因P72，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于毒株检测和出入境快速筛查，且检测结果准确性高，重复性好。
技术实现思路
：为了解决非洲猪瘟检测常规检测方法效率低、对于仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，本专利技术旨在提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-HNB可视化检测试剂盒，所述LAMP检测试剂盒可以实现非洲猪瘟病毒的快速检测，检测结果可以直接目测，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖，且所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的非洲猪瘟现场检测手段。另外本专利技术采用了可视化检测手段，当样品颜色由紫罗兰色变为天蓝色则说明其为阳性，只需要观察反应产物的颜色即可实现样品检测结果的判断，简单易学，适合临床和基层检测。本专利技术的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-HNB可视化检测试剂盒，该试剂盒采用环介导等温扩增技术通过对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的编码基因B646L基因的检测，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查，且该试剂盒通过显色反应，更加有助于判断检测结果。本专利技术的第二个目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，该检测方法可快速检出ASF，检测结果准确性高，重复性好。所述方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的，例如，科研当中病毒的确认、病毒的分型鉴定等。为了实现上述目的，本专利技术提供非洲猪瘟病毒LAMP–HNB可视化检测试剂盒，所述试剂盒由LAMPMix、PrimerMix、5MBetain、BstDNAPolymerase、去离子水、阴性对照和阳性对照组成，所述PrimerMix包含SEQIDNo.1-SEQIDNo.6的引物组。所述LAMPMix、5MBetain、BstDNAPolymerase均为购自海基生物科技有限公司的LAMP-HNB变色扩增试剂盒中的2×HNBLAMPMix、5MBetain、Bst2.0DNAPolymerase，货号：A3802。所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物。其核苷酸序列分别如下所示：外引物：4F3ACGCAGAGATAAGCTT(SEQIDNo.1)4B3AAGGTAATCATCATCGC(SEQIDNo.2)内引物：4FIPTGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC(SEQIDNo.3)4BIPCCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT(SEQIDNo.4)环引物4LoopFATAGATGAACATGCGTC(SEQIDNo.5)4LoopBAGTTCTGCAGCTCTTA(SEQIDNo.6)优选的，所述PrimerMix中4FIP、4BIP、4LoopF、4LoopB、4F3、4B3与去离子水的最佳配比为10∶10∶4∶4∶1∶1∶250。优选的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为无菌水，优选采用双蒸水、三蒸水或者DEPC水。优选的，所述阳性对照为含有p72基因的质粒DNA。优选的，所述p72基因的序列如SEQIDNo.7所示。本专利技术另提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有HNBLAMPMix12.5μl，Primermix7.5μl，5MBetain2μl，模板DNA2μl，BstDNAPolymerase1μl，总量25μl，然后于63-68℃下反应30-60min；(3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变色，若呈现天蓝色判定为阳性，呈现紫罗兰色则判定为阴性。所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的。优选的，反应的温度为65℃，时间为40min。基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：第一，本专利技术选取非洲猪瘟病毒的保守基因序列p72作为检测的目标基因，能够检测多种基因型和不同的毒株可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，对于猪场或者养殖区域进行净化工作具有重要的意义。第二，本专利技术采用LAMP技术，其特异性高，仅能特异性扩增非洲猪瘟病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒LAMP–HNB可视化检测试剂盒，所述试剂盒由HNB‑LAMP Mix、Primer Mix、5M Betain、Bst DNA Polymerase、去离子水、阴性对照和阳性对照组成，所述Primer Mix包含SEQ ID No.1‑ SEQ ID No.6的引物组。

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒LAMP–HNB可视化检测试剂盒，所述试剂盒由HNB-LAMPMix、PrimerMix、5MBetain、BstDNAPolymerase、去离子水、阴性对照和阳性对照组成，所述PrimerMix包含SEQIDNo.1-SEQIDNo.6的引物组。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP–HNB可视化检测试剂盒，所述HNB-LAMPMix、5MBetain、BstDNAPolymerase均为购自海基生物科技有限公司的LAMP-HNB变色扩增试剂盒中的2×HNBLAMPMix、5MBetain、Bst2.0DNAPolymerase，货号：A3802。3.根据权利要求所述的非洲猪瘟病毒LAMP–HNB可视化检测试剂盒，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：外引物：4F3ACGCAGAGATAAGCTT（SEQIDNo.1）4B3AAGGTAATCATCATCGC（SEQIDNo.2）内引物：4FIPTGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC（SEQIDNo.3）4BIPCCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT（SEQIDNo.4）环引物4LoopFATAGATGAACATGCGTC（SEQIDNo.5）4LoopBAGTTCTGCAGCTCTTA（SEQIDNo.6）所述PrimerMix中4FIP、4BIP、4Lo...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，张磊，张志刚，董剑辉，张满义，洪金，郭晶莹，潘玉，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61