一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒。为应对2018年在我国发现的非洲猪瘟疫情，本发明专利技术使用非洲猪瘟病毒P72基因作为LAMP检测的引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒基因P72，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于毒株检测和出入境快速筛查。所述LAMP检测方法可以实现非洲猪瘟病毒的快速检测，检测结果可以直接目测，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖，且所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的非洲猪瘟现场检测手段。

A LAMP Kit for Detection of African Swine Fever Virus and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒及其应用
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒及其应用。
技术介绍
：非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病时间短，病死率高。ASF是对养猪业危害最为严重的疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病，被我国列为一类传染病。ASFV属于双链DNA病毒目非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，该属目前仅有一个ASFV病毒种。ASFV的基因组为单分子线状DNA，长度约170～190kb。ASFV个体较大，直径可达200nm，表面为二十面体结构和一层含类脂的囊膜，因此高温和一些破坏囊膜的消毒剂均可有效杀灭ASFV。但是由于其复杂的分子结构，ASFV对消毒剂的抵抗力较其他的囊膜病毒稍强，特别是在一些猪肉制品或血液中存活时间更长。据报道，ASFV在在血液、粪便和组织中存活时间长达半年，在生肉或者未完全煮熟的猪肉制品中存活时间长达3个月，这就导致ASFV一旦传入，往往在疫源地长期存在，造成二次或次级感染。非洲猪瘟的发病率和病死率均可达到100％，且目前世界范围内尚无有效疫苗问世，其扩散和流行对养猪产业可能造成毁灭性打击，由此产生的间接损失则无法估量。现有的实验室检测方法主要有血清学方法和病原学方法。血清学方法主要有间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验等，其中酶联免疫吸附试验已经有商品化的试剂盒出售。ASFV的病原学方法也有很多，如病毒的细胞培养和分离、直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA法、普通PCR和荧光PCR方法等，其中OIE推荐的普通PCR和荧光PCR方法最为常用。我国《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》中提到了3种ASFV病原学检测方法：双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应(OIE官方网站)。除此以外，还要加大ASF防控技术研制工作力度，尽快开发简易、高效、特异的诊断试剂和诊断方法，并能够与古典猪瘟、高致病性猪蓝耳病等其他猪群疫病相鉴别。环介导等温扩增法(Loopmediatedisothermalamplificationmethod,LAMP)是一种新兴的核酸扩增技术，它采用独特的引物设计实现等温条件下的核酸快速扩增。在现有期刊文献中也出现了多篇LAMP检测非洲猪瘟的文章，例如江彦增等①、杨吉飞等②、王彩霞等③、王华等④均建立了非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法，然而，市场上并未出现相关的产品。为了将该技术运用到ASFV的检测和产品中，应对2018年在我国发现的非洲猪瘟疫情，本研究使用非洲猪瘟病毒P72基因作为LAMP检测的引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒基因P72，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于毒株检测和出入境快速筛查，且检测结果准确性高，重复性好。
技术实现思路
：为了解决非洲猪瘟检测常规检测方法效率低、对于仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，本专利技术旨在提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒及应用，所述LAMP检测方法可以实现非洲猪瘟病毒的快速检测，检测结果可以直接目测，仅需加热即可实现整个反应，摆脱了传统核酸检测技术对于PCR仪器的依赖，且所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的非洲猪瘟现场检测手段。本专利技术的目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组，该引物组特异性检测非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的编码基因B646L基因。本专利技术的另一目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，该试剂盒采用环介导等温扩增技术通过对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的编码基因B646L基因的检测，可以有效检出ASFV，为非洲猪瘟防控提供新的技术手段，有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。本专利技术的第三个目的在于提供非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，该检测方法可快速检出ASF，检测结果准确性高，重复性好。所述方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的，例如，科研当中病毒的确认、病毒的分型鉴定等，或者生鲜猪肉或猪肉制品中是否存在非洲猪瘟病毒。为了实现上述目的，本专利技术提供非洲猪瘟病毒LAMP检测引物组，所述引物组包括：一对外引物、一对内引物、一对环引物。其核苷酸序列分别如下所示：外引物：4F3ACGCAGAGATAAGCTT(SEQIDNo.1)4B3AAGGTAATCATCATCGC(SEQIDNo.2)内引物：4FIPTGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC(SEQIDNo.3)4BIPCCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT(SEQIDNo.4)环引物4LoopFATAGATGAACATGCGTC(SEQIDNo.5)4LoopBAGTTCTGCAGCTCTTA(SEQIDNo.6)本专利技术另提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组。优选的，所述试剂盒包含以上所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。优选的，外引物、环引物、内引物的摩尔比为4FIP：4BIP：4LoopF；4LoopB：4F3；4B3为10∶10∶4∶4∶1∶1。优选的，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。所述LAMP反应液可以为商业化购买的缓冲液，例如荣研生物科技(中国)公司核糖核酸扩增试剂盒中的缓冲液、新海基因的LAMP浊度扩增试剂盒(产品编号：A3803A/A3803B)等，或者是自行配制的LAMP反应液。优选的，所述LAMP反应液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液。优选的，所述阳性对照为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照为无菌水，优选采用双蒸水、三蒸水或者DEPC水。优选的，所述阳性对照为含有p72基因的质粒DNA。优选的，所述p72基因的序列如SEQIDNo.7所示。本专利技术另提供一种非洲猪瘟病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)环介导等温扩增反应：配置25μL反应体系，所述反应体系含有以上所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液和待测样品DNA，用无菌水补齐到25μL，然后于63-68℃下反应30-60min；(3)结果分析：通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带，如反应管中溶液变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带则判定为阳性，否则为阴性。优选的，还可以在环介导等温扩增反应体系中增加显色剂或者荧光物质，通过颜色变化或者荧光检测进行结果的判定。优选的，反应温度为65℃，反应时间为40min。所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测方法可以用于疾病的诊断，如非洲猪瘟的诊断；也可以用于非疾病的诊断目的。基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：第一，本专利技术选取非洲猪瘟病毒的保守基因序列p72作为检测的目标基因，能够检测多种基因型和不同的毒株可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，对于猪场或者养殖区域进行净化工作具有重要的意义。第二，本专利技术采用LAMP技术，其特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID No：1‑6所述的引物，具体引物序列如下：外引物：4F3 ACGCAGAGATAAGCTT（SEQ ID No.1）4B3 AAGGTAATCATCATCGC（SEQ ID No.2）内引物：4FIP TGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC（SEQ ID No.3）4BIP CCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT（SEQ ID No.4）环引物4LoopF ATAGATGAACATGCGTC（SEQ ID No.5）4LoopB AGTTCTGCAGCTCTTA（SEQ ID No.6）。

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包含SEQIDNo：1-6所述的引物，具体引物序列如下：外引物：4F3ACGCAGAGATAAGCTT（SEQIDNo.1）4B3AAGGTAATCATCATCGC（SEQIDNo.2）内引物：4FIPTGATCGGATACGTAACGGGATAGAGATACAGCTCTTC（SEQIDNo.3）4BIPCCGTAACTGCTCATGGTACGTAGTGGAAGGGTAT（SEQIDNo.4）环引物4LoopFATAGATGAACATGCGTC（SEQIDNo.5）4LoopBAGTTCTGCAGCTCTTA（SEQIDNo.6）。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，外引物、环引物、内引物的摩尔比为4FIP：4BIP：4LoopF；4LoopB：4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，张磊，张志刚，董剑辉，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61