本申请公开了用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请试剂，包括特异性引物对和探针，引物对上下游引物分别为SeqIDNo.1和2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列；SEQIDNo.3所示序列中，第32碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，第33碱基替换为碱基类似物，第35碱基修饰荧光基团‑dT，3’末端修饰C3Spacer。本申请试剂，能通过一步法逆转录重组酶聚合酶扩增对鹿流行性出血热病毒进行灵敏、特异、高效检测。采用本申请试剂可方便的对鹿流行性出血热病毒进行现场检测，快速获得检测结果；对于鹿流行性出血热病毒快速防控，防止疫情传播，最大限度保障生产安全具有重大意义。
Reagent, detection method and application for detection of deer epidemic hemorrhagic fever virus
【技术实现步骤摘要】
用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
本申请涉及鹿流行性出血热病毒检测领域，特别是涉及一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用。
技术介绍
鹿流行性出血热病(Epizootichemorrhagicdiseaseofdeer,EHD)是由呼肠弧病毒科环状病毒属的鹿流行性出血热病毒(EHDV)引起的疾病。EHD是昆虫库蠓属传播的影响野生和家养的反刍动物感染的非接触性传染病，是重要的虫媒病之一。在自然条件下，EHDV可引起牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物感染，其中白尾鹿是受EHDV影响最严重的物种。鹿感染该病毒后体温升高，黏膜和浆膜面广泛出血，急性型死亡率高。EHDV严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展，世界动物卫生组织将EHD列为法定报告传染病。鹿流行性出血热病毒与蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒同属于呼肠孤病毒科环状病毒属，为双股RNA病毒，无囊膜。由三个同心蛋白层组成一个二十面体病毒核，直径约80nm。EHDV有一个10段的RNA基因组，可以编码7种结构蛋白，即VP1至VP7，分为两个衣壳。内衣壳层由120个拷贝的结构蛋白VP3，包裹着VPl、VP4、VP6三个次要蛋白成分，以及病毒基因组；外衣壳层由780个拷贝的VP7和60个三聚VP2、180个三聚VP5组成，在EHDV感染细胞中还发现三种不同的非结构蛋白NS1、NS2和NS3/NS3a。国际病毒分类委员会(ICTV)网站查询显示EHDV有八种血清型。EHDV-1和EHDV-2都是野生有蹄类动物大规模疫情的罪魁祸首，尤其是白尾鹿，有时会造成严重的死亡。EHDV-1即NewJerseystrain-USA1955/01，首次在美国东北部发现，EHDV-21962年在加拿大阿尔伯塔省南部首次发行，但也在澳大利亚和日本传播。EHDV血清型3和血清型4只在非洲报道过。血清型5至8最初是在澳大利亚有报道。最初只有EHDV-1和EHDV-2在多个大陆上被发现。然而，最近在中东和美国都发现了EHDV-6，2006年在以色列也发现了EHDV-7，表明其他EHDV血清型也存在于广泛分离的地理位置。EHDV常规检测和分型程序包括从鸡胚或绵羊中分离病毒，或适应细胞培养，然后在“病毒中和试验”(VNT)中使用针对已建立血清型的参考抗血清进行分型。然而，上述方法成本高、耗时长，并且需要获得参考病毒或抗血清。近年来实时荧光PCR在动物疫病诊断检测方面应用广泛，与传统血清学方法相比，该方法快速、可靠，已成为许多实验室的标准诊断检测方法。目前已经有部分关于EHDV种或血清组特异性PCR检测的相关研究和报道；但是，这些检测都需要借助特殊的仪器设备，并且检测流程相对复杂，难以适用于现场检测。EHD是一种外来病，虽然我国暂未见发现该病的报道，但随着我国进口动物及动物产品贸易量的不断增长，EHD存在传入我国的风险，一旦传入将会给我国的养殖业造成巨大影响，因此亟需建立一种能够更好的适用于现场快速检测的EHDV检测方法，以防止EHDV传入或扩散。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，该试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的鹿流行性出血热病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列；SeqIDNo.1：5’-ATAAGAGGGACTGGTATTTGGGAAAATGATGAAT-3’SeqIDNo.2：5’-CCAAAGCAGACGAAGCAAAATAGTCTGAACATGAT-3’SeqIDNo.3：5’-CAGGAGGGAATCTATCTGCTAGCGAGAGTGCTACTACGCTGGGAACTATC-3’其中，SEQIDNo.3所示的探针序列中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对鹿流行性出血热病毒设计的，是特别用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的引物和探针。一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，缩写RT-RPA，是在重组酶聚合酶扩增反应体系的基础上添加逆转录酶，使其可以直接对RNA模板进行一步法快速扩增。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常规PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，分别设计了2条RPA探针，并针对每条探针分别设计了3条上游引物和3条下游引物，用于试验筛选，最终筛选出SeqIDNo.1所示序列和SeqIDNo.2所示序列的引物对，以及SEQIDNo.3所示序列的探针，作为本申请的鹿流行性出血热病毒检测试剂。还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQIDNo.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。优选的，碱基类似物为dSpacer。优选的，荧光基团-dT为6-FAM-dT。需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。本申请的另一面公开了本申请的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂在鹿流行性出血热病毒非诊断治疗目的的检测中的应用。可以理解，本申请的鹿流行性出血热病毒的检测试剂和方法，虽然可以为鹿流行性出血热病的诊断或治疗提供参考依据；但是，本申请的目的并非通过本申请的试剂或方法对鹿流行性出血热病进行诊断，本申请的目本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的鹿流行性出血热病毒特异性引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列；Seq ID No.1：5’‑ATAAGAGGGACTGGTATTTGGGAAAATGATGAAT‑3’Seq ID No.2：5’‑CCAAAGCAGACGAAGCAAAATAGTCTGAACATGAT‑3’Seq ID No.3：5’‑CAGGAGGGAATCTATCTGCTAGCGAGAGTGCTACTACGCTGGGAACTATC‑3’其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团‑dT，3’末端修饰C3Spacer。
【技术特征摘要】
1.一种用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的鹿流行性出血热病毒特异性引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列；SeqIDNo.1：5’-ATAAGAGGGACTGGTATTTGGGAAAATGATGAAT-3’SeqIDNo.2：5’-CCAAAGCAGACGAAGCAAAATAGTCTGAACATGAT-3’SeqIDNo.3：5’-CAGGAGGGAATCTATCTGCTAGCGAGAGTGCTACTACGCTGGGAACTATC-3’其中，SEQIDNo.3所示的探针序列中，第32个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，第33个碱基替换为碱基类似物，第35个碱基修饰荧光基团-dT，3’末端修饰C3Spacer。2.根据权利要求1所述的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。3.根据权利要求1所述的用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂，其特征在于：所述碱基类似物为d...
【专利技术属性】
技术研发人员：林彦星，花群俊，黄超华，史卫军，曹琛福，张彩虹，杨俊兴，花群义，
申请(专利权)人：深圳海关动植物检验检疫技术中心，武定县动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东,44
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