本发明专利技术公开了一种用于检测塞尼卡谷病毒(SVV)的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。本发明专利技术能对塞尼卡谷病毒实施快速检测，可为疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗提供依据，指导塞尼卡谷病毒疫苗生产。本发明专利技术的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对塞尼卡谷病毒的准确定量，将在塞尼卡谷病毒的检测及疫苗生产中发挥重要作用。
Real-time fluorescence quantitative PCR kit for detection of Seneca Valley virus and its specific primers and TaqMan probe
【技术实现步骤摘要】
塞尼卡谷病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针
本专利技术属于生物检测
中的兽医动物病原检测，特别涉及一种用于对塞尼卡谷病毒进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。
技术介绍
塞尼卡谷病毒塞尼卡谷病毒(SenecaValleyVirus(SVV)或SenecaVirusA(SVA))是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)SenecaVirus病毒属的典型代表，与心病毒属(CardioVirus)最接近，是主要发生于猪的一种传染病，其临诊特征为感染猪只鼻部和口腔形成溃疡、厌食、跛行，导致新生仔猪急性死亡。早期塞尼卡谷病例主要发生于育肥猪，鼻部、口部和蹄部的冠状带部可见水疱症状，但最近发现的一些塞尼卡谷阳性病例发生于新生仔猪，症状为腹泻，无水疱病变，这些病例主要是通过对血清、粪便和不同组织进行PCR检测发现的。塞尼卡谷病毒基因组结构塞尼卡谷病毒是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，无囊膜包被,直径约27nm，衣壳蛋白呈二十面体，基因组全长约7.2kb，包括5’端、3’端和一个开放阅读框(ORF)，基因组3’端的末端有短的poly(A)和一个非翻译序列(3’-UTR),开放阅读框包含L蛋白及结构蛋白的P1区和非结构蛋白的P2区和P3区，P1区编码4个结构蛋白(1A-1D)，P2和P3区编码7个非结构蛋白(2A-2C、3A-3D)，与口蹄疫病毒基因组结构相似。塞尼卡谷病毒的流行情况和疫苗2002年，美国马里兰州的一家公司在细胞培养基中偶然发现了塞尼卡谷病毒。塞尼卡谷病毒最初被认为是PER.C6细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。在2007年之前，SVV主要作为溶瘤细胞被研究，可有效治疗一些神经内分泌肿瘤。到2007年，一批从加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡、蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为塞尼卡谷病毒阳性。2014年11月，巴西也出现猪群感染塞尼卡谷病毒，发病母猪鼻部及蹄部有水泡及溃烂创面，感染仔猪(4日龄以内)出现神经症状并且死亡，死亡率达30％-70％。2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡，发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为塞尼卡谷病毒阳性并通过猪睾丸细胞(ST细胞)分离得到塞尼卡谷病毒。2015年3月，我国广东某猪场断奶猪出现鼻镜水泡，经送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示猪口蹄疫、猪水疱病病原均阴性。经多种病毒检测及基因测序结果发现与塞尼卡谷病毒序列的相似性最高，确定发病猪群感染塞尼卡谷病毒，并分离到塞尼卡谷病毒。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其它猪场发现猪群感染塞尼卡谷病毒病例。目前，如何用快速、简单的方法检测塞尼卡谷病毒是一些猪场急需解决的问题。塞尼卡谷病毒抗体在猪、老鼠及牛身上均被检测到，目前尚未有报道证实塞尼卡谷病毒可感染人并引发临床症状。疫苗是预防病毒的最有效措施，制备灭活疫苗是预防塞尼卡谷病毒流行的主要有效手段，灭活疫苗在传染病的预防中发挥这着重要作用，对病原进行了有效的灭活，可提供安全的疫苗，主要通过将塞尼卡谷病毒体外培养后、灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。塞尼卡谷病毒的检测实时荧光定量PCR技术具有特异性高、可靠、快速，广泛应用于兽医动物病原的分子生物学检测。目前，针对塞尼卡谷病毒检测技术的相关研究比较少，普遍采用的方法包括普通PCR检测技术和实时荧光定量PCR检测技术，其问题在于普通PCR检测技术因只采用一对引物进行检测，对目的序列的适应性强，导致核酸序列同源性高的病毒也出现特异性条带，从而出现假阳性结果，并且普通PCR检测技术的敏感度低于实时荧光定量PCR检测技术。不同实时荧光定量PCR方法设计的引物和探针序列的位点不同，在进行塞尼卡谷病毒检测时，其敏感性也不相同，如赵晓亚在“一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒”(CN201610379248.2)的专利文献(文献1)中用实时荧光定量PCR技术检测病毒的敏感性为102copies/μL，而樊晓旭等(中国预防兽医学报.2016.38(12)；959-962)文献(文献2)中建立的一种快速、灵敏的检测塞尼卡谷病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性为2.8×102copies/μL，敏感性高于普通PCR技术，且与口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应。因此，寻找一个好的位点进行塞尼卡谷病毒的实时荧光定量PCR检测很有必要。而准确、特异、快速地检测不仅对塞尼卡谷病毒的流行与临床诊断有意义，针对塞尼卡谷病毒抗原水平的检测在疫苗生产监控等方面也同样具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供用于对塞尼卡谷病毒(SVV)进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，并实现塞尼卡谷病毒(SVV)的定性、定量检测。本专利技术所提供的用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物为：上游引物(SVV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(SVV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。由上述引物衍生的引物序列也属于本
技术实现思路
。所述衍生序列是指在SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。本专利技术所提供的用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针为：TaqMan探针(SVV-P)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本
技术实现思路
。所述衍生序列是指在SEQIDNO：3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。所述用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVV-P)的5’端报告荧光基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为TAMRA。为防止PCR扩增时被延伸，所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。本专利技术的第二个目的是提供用于对塞尼卡谷病毒(SVV)进行实时荧光定量PCR检测试剂盒。本专利技术所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR检测体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL(购于TakaRa公司)，TaKaRaExTaqHS0.5μL(购于TakaRa公司)，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL(购于TakaRa公司)，SVV-F(20μM)0.5μL，SVV-R(20μM)0.5μL，SVV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O7.5μL。本专利技术的第三个目的是提供所述引物、探针或试剂盒在对塞尼卡谷病毒(SVV)进行非疾病诊断目的的检测应用。该应用之一为一种用上述实时荧光定量PCR检测试剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，其特征在于：是根据塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)的3C区域特异性保守序列设计得到，该特异性保守序列为塞尼卡谷病毒自5’端第6564‑6820位碱基，其核苷酸序列如序列表中SED ID NO：4所示。
【技术特征摘要】
1.用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，其特征在于：是根据塞尼卡谷病毒(SenecaValleyVirus，SVV)的3C区域特异性保守序列设计得到，该特异性保守序列为塞尼卡谷病毒自5’端第6564-6820位碱基，其核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：4所示。2.根据权利要求1所述的用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述引物为：上游引物(SVV-F)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：1所示，下游引物(SVV-R)的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示；所述TaqMan探针为：TaqMan探针(SVV-P)的核苷酸序列如序列表中SEDIDNO：3所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。3.根据权利要求1所述的用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述TaqMan探针(SVV-P)的5’端报告荧光基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为TAMRA。4.用于对塞尼卡谷病毒(SVV)进行实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括权利要求1或2或3所述的用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。5.根据权利要求4所述的用于对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR检测体系的试剂：实时荧光定量一步法PCR反应液2×OneStepRT-PCRBufferIII12.5μL，TaKaRaExTaqHS0.5μL，PrimeScriptRTEnzymeMixII0.5μL，SVV-F(20μM)0.5μL，SVV-R(20μM)0.5μL，SVV-P(10μM)1μL，RNA-freeH2O7.5μL。6.权利要求1或2或3所述的引物和TaqMan探针或权利要求4或5所述的试剂盒在对塞尼卡谷病毒(SVV)进行非疾病诊断目的的检测应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：对样品中塞尼卡谷病毒抗原浓度进行检测，样品包括塞尼卡谷病毒疫苗或多价疫苗的生产原料、灭活液、浓缩液及成品，对疫苗生产各环节中的病毒浓度进行质控。8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：为一种用实时荧光定量PCR技术对塞尼卡谷病毒的定性、定量检测方法，包括以下步骤：1)建立标准曲线：以塞尼卡谷病毒的3C区域基因的特异性保守序列(塞尼卡谷病毒自5’端第6564-6820位碱基，序列表中SEDIDNO：4，检测基因)作为标准品构建序列，设计对塞尼卡谷病毒进行实时荧光定量PCR检测的标准品...
【专利技术属性】
技术研发人员：王秀明，陈君彦，魏学峰，刘国英，关平原，范秀丽，张贵刚，王艳杰，王云凌，张宸，武瑾贤，张燕红，杜宇荣，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15
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