一种快速检测甜椒CMV病毒病的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测甜椒CMV病毒病的方法，涉及核酸检测技术领域，该方法根据CMV基因组序列保守区域设计合成一对特异引物：CMV：上游引物（CMV‑F）5’‑ATGGACAAATCTGAATCAACC‑3’和下游引物（CMV‑R）5’‑TAAGCTGGATGGACAACCCGT‑3’，整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过多次预试验，反复摸索和调整体系因素，最终获得了使所选引物在同一RT‑PCR反应管中正常反应的最佳条件，成功构建基于一步法RT‑PCR检测甜椒感染CMV病毒的方法；本发明专利技术提供的方法将为甜椒农业生产过程中CMV的准确检测提供一种更加简便、灵敏、特异的方法。

A Rapid Method for Detecting CMV Virus Disease in Sweet Pepper

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测甜椒CMV病毒病的方法
本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及一种快速检测甜椒CMV病毒病的方法。
技术介绍
黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）已成为甜椒栽培生产上危害最为严重的病毒之一，感染CMV病毒会对甜椒的农业生产造成重大损失。针对CMV病毒病具有危害大、流行广、防治难的特点，尽快建立快速、准确和高效的检测技术十分必要。目前检测CMV病毒病的方法主要有指示植物法、ELISA法、电镜法等检测方法，但都存在不同程度的缺陷和不足。常规生物学检测费时费力，ELISA法和分子生物学检测方法对制备病毒样品材料要求较高、易受实验条件的限制且费用昂贵。RT-PCR（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）检测方法相对其他检测方法，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。正常情况下，RT-PCR在实际应用过程中，分为两个操作步骤来进行，首先对目的病毒核酸进行反转录，然后以反转录的产物cDNA为模板进行PCR扩增获得相应病毒病原鉴定信息。两个反应步骤和阶段对应两个不同的反应体系，整个试验的影响因素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测甜椒CMV病毒病的方法，其特征在于，该方法应用于检测甜椒黄瓜花叶病毒病，所述方法包括以下步骤：步骤一、使用DNAMAN6.0软件，对GenBank收录的CMV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列作对比，确定病毒序列中的相对保守区域，在选定的保守区域内使用Primer Premier 5.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物特异性，根据PCR要求，设计CMV引物一对，如下所示：CMV：上游引物（CMV‑F）：5’‑ ATGGACAAATCTGAATCAACC‑3’    下游引物（CMV‑R）：5’‑ TAAGCTGGATGGACAACCCGT‑3’，CMV引物人工合成后...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测甜椒CMV病毒病的方法，其特征在于，该方法应用于检测甜椒黄瓜花叶病毒病，所述方法包括以下步骤：步骤一、使用DNAMAN6.0软件，对GenBank收录的CMV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列作对比，确定病毒序列中的相对保守区域，在选定的保守区域内使用PrimerPremier5.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物特异性，根据PCR要求，设计CMV引物一对，如下所示：CMV：上游引物（CMV-F）：5’-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3’下游引物（CMV-R）：5’-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3’，CMV引物人工合成后用去RNase水溶解至工作浓度10μM；步骤二、对接种过CMV病毒的甜椒进行取样，将样品在液氮中研磨成粉末，提取甜椒总RNA，将提取的RNA溶于50μL无RNA酶污染的双蒸水中，在-80℃条件下保存备用；步骤三、在30μLPCR反应体系中添加10mMdNTP混合物2μL、10×PCR缓冲液3μL、25mMMgCl21.5μL、10μM上下游引物各2μL、模板1μL、5U/微升lTaq酶0.25μL、20U/μLlM-MuLV反转录酶1μL、5U/μLRNA酶抑制剂0.5μL、去RNas...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋云鹏，龚繁荣，刘凯歌，张丽丽，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31