用于莲藕源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于莲藕源性成分检测的寡核苷酸引物与探针。本发明专利技术还涉及用于测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明专利技术还涉及用于快速检测莲藕源性成分的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于实时荧光PCR检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明专利技术还涉及针对莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测莲藕源性成分中的应用。使用本发明专利技术的实时荧光PCR检测方法和试剂盒，能够特异、灵敏、准确地测定藕粉等样品中是否含有莲藕源性成分。

【技术实现步骤摘要】
用于莲藕源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒
本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于莲藕源性成分检测的寡核苷酸引物和探针，用于测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测方法，用于快速检测莲藕源性成分的实时荧光PCR检测试剂盒以及莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测莲藕源性成分中的应用。。
技术介绍
莲藕(Nelumbonucifera)为睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，历史悠久，种质资源丰富。由于莲藕富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质、鞣质等，以莲藕为原料的藕粉及果汁等产品深受国内外消费者喜爱和食品研究者的关注。然而，为牟取利益，有些不法分子在藕粉产品中掺杂玉米、小麦、马铃薯、红薯和木薯等其他廉价的可食用淀粉。这些掺假行为，大多可利用扫描电镜法通过不同淀粉颗粒的超微形貌特性进行鉴别，但该方法无法对掺假藕粉中的木薯淀粉或甘薯淀粉进行鉴别，因为藕粉中除长棒形的典型藕粉颗粒外，还有一些小的不成熟的类似于球体碎块、半球体或大半个球体的小型藕粉颗粒，这些颗粒与木薯淀粉和红薯淀粉颗粒在超微形貌上极其相似。另外国家标准GB/T25733-2010《藕粉》中采用光学显微镜和偏光显微镜等检测手段判定藕粉，并将藕粉分级。但此法只能鉴别出类似于典型藕粉颗粒的淀粉颗粒，却无法确定这些长棒形颗粒是真的典型藕粉颗粒，还是马铃薯或芭蕉芋等其他大型淀粉颗粒。另外也有研究通过差示扫描量热仪对藕粉等常见几种淀粉的糊化过程进行比较，发现藕粉与其他淀粉在糊化吸热峰上有明显的差别，基于此也可将藕粉与其他淀粉进行区分。分子生物学技术的发展，弥补了常规化学检测技术的诸多不足，通过鉴定物种品种DNA水平上的差异来鉴定品种真实性和纯度，具有准确可靠、成本较低、不受环境因素影响，便于实现鉴定自动化，且可鉴定表型上难于鉴别的品种等。近几年来，实时荧光PCR技术已经广泛应用于肉类、水产品、奶制品等食品真实属性鉴别、食源性过敏原监测、转基因食品检测、食源性微生物筛查等领域。另外在谷物鉴别中也有所应用，如采用实时荧光PCR方法可准确鉴别小麦、大麦、燕麦及黑麦，检测灵敏度可达0.01%。目前，国内外尚未见报道能够快速、简便、特异且灵敏地检测藕粉等样品中莲藕源性成分的方法和试剂盒。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的莲藕源性成分的检测方法，进行藕粉等样品中莲藕源性成分的检测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供准确检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针。本专利技术的另一个目的在于，提供准确测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测方法。本专利技术的另一个目的在于，提供准确测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测试剂盒。本专利技术的还一个目的在于，提供莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在准确检测藕粉等样品中莲藕源性成分中的应用。针对上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术的专利技术人根据莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区设计了能特异性鉴别样品中莲藕源性成分的寡核苷酸引物对和探针，能从样品DNA中高效特异扩增出一段较短的莲藕特异性基因片段。根据本专利技术的一个实施方案，本专利技术提供用于实时荧光PCR方法检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和荧光标记探针，所述引物对和探针是根据ITS1-5.8S-ITS2间区序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Lotusroot-F：CCATGGAAGGGTGCATAATC（SEQIDNo.1），所述下游引物为Lotusroot-R：GAGATATCCGTTGCCGAGAG（SEQIDNo.2）；所述探针为Lotusroot：ATTGTTGGGTGTTTTGCCTC（SEQIDNo.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，本专利技术提供的莲藕特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供了用于实时荧光PCR方法定性检测莲藕源性成分的组合物，所述组合物包含莲藕特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述莲藕特异性引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQIDNo.1，所述下游引物的碱基序列为SEQIDNo.2；所述探针的碱基序列为SEQIDNo.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术提供莲藕源性成分的实时荧光PCR定性检测方法，所述方法包括使用针对莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对和探针是根据g3pdh基因序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，本专利技术的莲藕源性成分的实时荧光PCR定性检测方法中，所使用的莲藕特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQIDNo.1，所述下游引物的碱基序列为SEQIDNo.2；所述探针的碱基序列为SEQIDNo.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，所述的PCR扩增条件为95℃，10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术提供用于准确检测样品中莲藕源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术用于实时荧光PCR方法检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在本专利技术的试剂盒优选实施方案中，本专利技术的莲藕源性成分定性检测特异性寡核苷酸引物对是根据ITS1-5.8S-ITS2间区序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的莲藕特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQIDNo.1，所述下游引物的碱基序列为SEQIDNo.2；所述试剂盒中探针的碱基序列为SEQIDNo.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术提供用于准确定性检测莲藕源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术的用于实时荧光PCR方法鉴别莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。在试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含莲藕特异性寡核苷酸引物对SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和莲藕特异性探针SEQIDNo.3，在莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测莲藕源性成分的实时荧光PCR扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95℃，10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。在一个具体的实施方案中，本专利技术用于莲藕源性成分定性检测的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为红薯DNA。根据本专利技术的再一个实施方案，本专利技术提供本专利技术的用于实时荧光PCR方法检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中莲藕源性成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供藕粉、莲藕汁本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于实时荧光PCR方法检测样品中莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针组合物，其中所述引物对为Lotus root‑F：CCATGGAAGGGTGCATAATC，所述下游引物为Lotus root‑R：GAGATATCCGTTGCCGAGAG；所述探针为Lotus root：ATTGTTGGGTGTTTTGCCTC。

【技术特征摘要】
1.用于实时荧光PCR方法检测样品中莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针组合物，其中所述引物对为Lotusroot-F：CCATGGAAGGGTGCATAATC，所述下游引物为Lotusroot-R：GAGATATCCGTTGCCGAGAG；所述探针为Lotusroot：ATTGTTGGGTGTTTTGCCTC。2.根据权利要求1所述的组合物，其中在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖，韩建勋，黄文胜，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11