用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒，上游引物具有如SEQ ID No.1、4、7、10、13所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.2、5、8、11、14所示的核苷酸序列；荧光探针具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15所示的核苷酸序列；经取代、缺失或添加一个或多个碱基且与所述核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；与所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；该组合及检测方法具备极高的灵敏度和特异性，与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，若推向临床，具有很好的应用前景。

Primer Probe Combination and Kit for Detection of Five Respiratory Viruses

【技术实现步骤摘要】
用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别涉及用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒。
技术介绍
流感病毒属正粘病毒科，病毒颗粒呈球状，直径为80nm-120nm，为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。流感病毒按照核蛋白和基质蛋白的不同可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。流感病毒主要传播途径是带有流感病毒的飞沫，经呼吸道进入体内。病毒传入人群后，传染性强并可迅速蔓延，传播速度和广度与人口密度有关。流感病毒感染导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。因此，做到甲型和乙型流感病毒的早诊断、早发现、早治疗十分关键。季节性H1N1流感是一种具有高度传染性的猪的急性呼吸道疾病，由几种猪A型流感病毒中的一种引起。发病率高死亡率低（1-4%）。病毒在猪群中通过气溶胶、直接和间接接触传播，无症状携带病毒的猪也可传播。在温带地区，猪间疫情全年均可发生，但秋冬季节发病较多。一般来说，季节性流感病毒H1N1存在种属特异性，只感染猪，但有时也能跨越种群屏障引起人类发病。人类通常从携带病毒的猪身上感染季节性流感病毒H1N1，然而，一些病例并没有猪接触史，或者未曾接触过猪所在的环境。在某些情况下已经发生了人-人传播，但仍局限在密切接触者以及与病人同处在封闭环境的人群中。人感染季节性流感病毒H1N1后的症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉咙痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻和呕吐，重者会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。目前对人类健康造成重大威胁的主要是以AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9为代表的禽流感亚型病毒。这些病毒由于RNA聚合酶缺乏校正功能，容易发生变异和重排，毒力越来越强。麻疹病毒属副粘病毒科麻疹病毒属，呈球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L6个基因，分别编码6个结构和功能蛋白。麻疹是儿童最常见的急性呼吸道传染病之一，其传染性很强，在人口密集而未普种疫苗的地区易发生流行约2-3年发生一次大流行。临床上以发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎等而以皮肤出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹粘膜斑及疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑为特征。近年来高致病性禽流感在世界各地的爆发呈上升趋势，不但严重危害禽类，也威胁哺乳动物，尤其是感染人类并致死，已对人类健康造成极大威胁，因此建立快速、准确的病毒检测手段至关重要。目前对于呼吸道病毒感染的临床诊断，多以临床症状及流行病学资料作为依据，而确诊需用病毒分离培养、血清学检测及病毒核酸的分子生物学检测等实验室诊断。在这些方法中，基于荧光定量的病毒核酸检测最为常用。而传统的荧光定量PCR方法尚存在试剂价格高，检测时间长、无法达到真正的即时检验（point-of-caretesting,POCT），不能实现便携、可移动及现场快检的要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种用于五种呼吸道病毒检测的引物探针组合及试剂盒。具体的，本专利技术提供了一种快速、高效、高通量和高灵敏度检测甲型流感病毒和禽流感病毒H1、H3、H5、H7的方法以及检测试剂盒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：组合一：（1）、上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和（2）、下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；和（3）、荧光探针具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；或（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合二：（6）、上游引物具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；和（7）、下游引物具有如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；和（8）、荧光探针具有如SEQIDNo.6所示的核苷酸序列；或（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合三：（11）、上游引物具有如SEQIDNo.7所示的核苷酸序列；和（12）、下游引物具有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列；和（13）、荧光探针具有如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列；或（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合四：（16）、上游引物具有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列；和（17）、下游引物具有如SEQIDNo.11所示的核苷酸序列；和（18）、荧光探针具有如SEQIDNo.12所示的核苷酸序列；或（19）、如（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（20）、与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合五：（21）、上游引物具有如SEQIDNo.13所示的核苷酸序列；和（22）、下游引物具有如SEQIDNo.14所示的核苷酸序列；和（23）、荧光探针具有如SEQIDNo.15所示的核苷酸序列；或（24）、如（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（25）、与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；在本专利技术的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H1、禽流感病毒H3或麻疹病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：组合一：（1）、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和（2）、下游引物具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；和（3）、荧光探针具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；或（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合二：（6）、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和（7）、下游引物具有如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；和（8）、荧光探针具有如SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；或（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合三：（11）、上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和（12）、下游引物具有如SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；和（13）、荧光探针具有如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列；或（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合四：（16）、上游引物具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和（17）、下游引物具有如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列；和（18）、荧光探针具有如SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列；或（19）、如（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（20）、与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合五：（21）、上游引物具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和（22）、下游引物具有如SEQ ID No. 14所示的核苷酸序列；和（23）、荧光探针具有如SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；或（24）、如（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（25）、与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列。...

【技术特征摘要】
1.引物探针组合，其特征在于，包括如下组合中的一种或两者以上：组合一：（1）、上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和（2）、下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；和（3）、荧光探针具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；或（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合二：（6）、上游引物具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；和（7）、下游引物具有如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；和（8）、荧光探针具有如SEQIDNo.6所示的核苷酸序列；或（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合三：（11）、上游引物具有如SEQIDNo.7所示的核苷酸序列；和（12）、下游引物具有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列；和（13）、荧光探针具有如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列；或（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列；组合四：（16）、上游引物具有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列；和（17）、下游引物具有如SEQIDNo.11所示的核苷酸序列；和（18）、荧光探针具有如SEQIDNo.12所示的核苷酸序列；或（19）、如（16）、（17）或（1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴诗品，金宁一，李体远，李昌，杜寿文，田明尧，任琴，张星艳，王宇航，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44