一种性传播疾病致病病原的核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种性传播疾病(Sexually transmitted diseases，STD)致病病原的核酸检测试剂盒。本发明专利技术研究得到可基于CRISPR/Cas12a检测STD相关病原的特异性核酸序列位点，针对该位点可实现STD病原的快递、灵敏、特异定性检测，基于该技术构建了STD病原核酸检测方法和检测试剂盒，既能实现靶标单分子精准检测，还能够实现多位点同时检测，临床检测效果优异，对于STD病原的检测与筛查具有重要的意义和应用前景。

A Kit for Nucleic Acid Detection of Pathogens of Sexually Transmitted Diseases

【技术实现步骤摘要】
一种性传播疾病致病病原的核酸检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种性传播疾病致病病原的核酸检测试剂盒。
技术介绍
性传播疾病(SexuallyTransmittedDisease,STD)是在全世界范围内流行的一种最常见的传染病，其发病、流行与生活方式密切相关，是以性接触为主要传播方式的一组疾病。近二十年来性传播疾病的流行逐渐呈现出流行范围扩大、罹患年龄减低和严重程度加重的态势，已成为全人类必须共同面对的严峻公共健康问题。梅毒、淋病、生殖器疱疹、尖锐湿疣、软下疳、非淋菌性尿道炎、性病性淋巴肉芽肿和艾滋病8种STD被列为中国重点防治的性病。STD可由病毒、细菌和寄生虫引起，常见的病原体有几种：人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)，沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)，苍白螺旋体(TreponemaPallidum，TP)，淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)，刚地弓形虫(ToxoplasmaGondii，TG)。为实现STD的早期检测并控制其传播风险，开发低成本、准确、高效、快速地检测STD病原的诊断方法非常重要。常规的病原检测技术如(1)分离培养技术：病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体检测的金标准。但该方法分离培养耗时长，无法实现短时间内迅速得到检测结果，必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-Sanger测序技术、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有STD病原检测技术的缺陷和不足，研究得到一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现STD病原的核酸检测，特异性好、灵敏度高，假阳性低。本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸检测位点及gRNA组合。本专利技术另一目的是提供一种STD病原基因的CRISPR/Cas12a检测系统。本专利技术再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸的检测方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。所述STD病原核酸检测靶标位点的序列如SEQIDNO.1-16任一所示。能特异性区分STD病原的不同型别且包含Cas12a识别的PAM序列。同时所述靶标位点在作为STD病原核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸检测位点方面的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。基于上述研究成果，本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原检测方法，是利用CRISPR/Cas12a系统检测上述靶标位点。具体是利用Cas12a蛋白和对应所述靶标位点的gRNA进行CRISPR核酸检测。所述gRNA的设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。作为优选的可选择方案，所述gRNA的序列如SEQIDNO.17-51任一或任几个所示。同时本专利技术还提供一种STD病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统或试剂盒，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA的序列对应于SEQIDNO.1-16任一所示靶标位点。优选地，所述gRNA的序列如SEQIDNO.17-51任一或任几个所示。另外，上述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白。比如LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a、AsCas12a等。所述ScCas12a的序列如SEQIDNO.52所示，所述SsCas12a的序列如SEQIDNO.53所示，所述LbCas12a的序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)，FnCas12a的序列参照Addgene号6-His-MBP-TEV-FnCpf1(Plasmid#90094)、AsCas12a的序列参照Addgene号AsCpf1-2NLS(Plasmid#102565)。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原核酸检测靶标位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现STD病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10-18摩尔/L)，实现靶标单分子检测；同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异，对于STD病原的检测与筛查具有重要的意义。附图说明图1为实施例2中对人类免疫缺陷病毒(HIV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图2为实施例2中对沙眼衣原体(CT)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图3为实施例2中对梅毒螺旋体(TP)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图4为实施例2中对刚地弓形虫(TG)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图5为实施例2中对淋病奈瑟菌(NG)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图6为实施例4中对10例淋病奈瑟菌阳性的临床样本的检测效果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。除非另有说明，本专利技术采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原检测方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas12a系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑16任一或任几个所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的STD病原检测方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas12a系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1-16任一或任几个所示。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用Cas12a蛋白和gRNA进行CRISPR核酸检测，所述gRNA以所述靶标位点为靶序列进行设计，设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQIDNO.17-51任一或任几个所示。4.一种STD病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翀，刘华勇，季宇，
申请(专利权)人：广州普世利华科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44