用于检测SARS-CoV-2的引物探针组合产品制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS‑CoV‑2的引物探针组合产品。所述引物探针组合产品包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针。本发明专利技术提供的试剂盒用于SARS‑CoV‑2病毒RNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为SARS‑CoV‑2病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于检测SARS-CoV-2的引物探针组合产品
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测SARS-CoV-2的引物探针组合产品。
技术介绍
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)，是一种具有包膜的正链单股RNA病毒，属于冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种。它的基因序列和SARS病毒及MERS病毒属于同一谱系但不同进化枝，是已知的第七种可感染人类的冠状病毒。病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物，它造成了新型冠状病毒病(COVID-19)。SARS-CoV-2病毒可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的ACE2为受体达到感染；主要感染器官包括肺部、心脏、肾脏等多个主要器官。SARS-CoV-2病毒的其中一个特点是传染性极强，因此，尽早的对感染患者做出诊断以及有效的隔离，是对SARS-CoV-2病毒传播控制的关键点。在新型冠状病毒肺炎诊疗方案中，对SARS-CoV-2病毒病原学包括RT-PCR和NGS方法。RT-PCR有着相对较短的检测周期，且每轮测试可以同时检测多个样本，配合混样等处理，可以在相对短时间内实现较高通量的样本检查，但是该法需要依赖于较为复杂的检测流程和相对复杂高价的仪器，同时对于检测环境的要求很高，目前需要在疾控中心等地集中检测，容易面临检测试剂有限、检测仪器和实验人员均超负荷运转等问题，无法广泛普及至广大基层医院、防控现场和家庭。NGS方法不单可以准确地确认SARS-CoV-2病毒的有无，还可以识别基因组中的突变，对于病毒溯源、流行病学追踪均有重要意义，但检测周期至少需要24小时以上，操作复杂，需要专业技术人员实施，难以满足快速检测及对阳性人员进行快速隔离的要求。由于能在单一温度进行反应，不需要仪器进行复杂得温度变化控制，恒温扩增技术对硬件的要求相比qPCR大大降低。但现有的恒温扩增技术在灵敏度、特异性等方面与qPCR相比仍有一定差距，因此没有得到广泛的推广和应用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一方面涉及引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～4所示；环引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5～6所示；探针的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，其中，探针5’端第14位核苷酸为核糖核苷酸。本专利技术的第二方面涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合产品。本专利技术的第三方面涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于检测SARS-CoV-2的诊断试剂或试剂盒中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1)本专利技术提供的试剂盒用于SARS-CoV-2病毒RNA检测，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为SARS-CoV-2病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。2)本专利技术提供的试剂盒采用核糖核酸酶HII报告系统，与恒温扩增同步反应，在55～65℃条件下均可实现靶基因的有效扩增及检测，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，10-40min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为500copies/mL。3)本专利技术方法中核糖核酸酶HII对探针和靶标序列具有高度特异性，只有扩增产物和探针序列完全互补才发出荧光信号，使扩增的特异性大大提高，从而实现无本底背景的高效恒温核酸扩增。4)检测所需反应条件简单，对硬件要求低，成本较低，利于技术的广泛推广。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中对两组引物探针的验证结果；图2为本专利技术一个实施例中不同拷贝数的N基因的检测结果；图3为本专利技术一个实施例中对本专利技术所提供的引物探针的特异性验证结果；图4为本专利技术一个实施例中试剂盒稳定性检测结果。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术涉及引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～4所示；环引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5～6所示；探针的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，其中，探针5’端第14位核苷酸为核糖核苷酸。FIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3端有与靶序列的F2c区互补的F2区并且在5端有与靶基因的F1c区相同的序列。F3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因F3c区互补的F3区。BIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3'端有与靶序列B2c区互补的B2区并且在5端有与靶基因Blc区相同的序列。B3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因B3c区互的B3区。使用本专利技术引物组时，可加入一或两类环状引物(LF引物或LB引物)以便加速核酸扩增反应。设计这样的环状引物以使其退火至F1和F2之间的区域或B1和B2之间的区域，然后加入到LAMP反应系统。这样，这些引物与在核酸扩增过程中未使用的环状部分结合，以致利用所有的环状部分作为起点促进核酸反应，从而加速核酸扩增反应。上述引物探针组合产品能够配合核糖核酸酶HII实现对SARS-CoV-2更加灵敏和特异性的诊断。核糖核酸酶HII(RNaseHII)为核糖核酸内切酶，适用于在双链DNA内部切刻核糖核酸的5′末端，产生5′磷酸和3′羟基末端。RNaseHII可以特异性地识别DNA双链中的RNA碱基，并使RNA碱基5’方向连接DNA碱基的磷酸二酯键断裂，导致DNA双链在RNA碱基的5’方向产生了一个切口。在生物体内，通过该切割引发DNA修复，可去除双链DNA中的RNA碱基，确保遗传信息的准确性。本专利技术基于RNaseHII对底物严格配对要求的特性，设计了一种单链探针，该探针内部嵌入了RNA碱基，并将RNaseHII应用于扩增系统的报告体系中。由于RNa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；/nF3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～4所示；/n环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示；/n探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中，探针5’端第14位核苷酸为核糖核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；
F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQIDNO：1～4所示；
环引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5～6所示；
探针的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，其中，探针5’端第14位核苷酸为核糖核苷酸。


2.根据权利要求1所述的组合产品，所述探针在核糖核苷酸两侧的DNA碱基分别标记有荧光基团和淬灭基团。


3.根据权利要求2所述的组合产品，所述探针的荧光基团选自AMCA、PacificBlue、Atto425、BODIPYFL、FAM、AlexaFluor488、TET、JOE、YakimaYellow、VIC、HEX、Quasar570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor593、TexasRed、Atto590、Cy5、Quasar670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧卓，冯耀恒，陈翀，
申请(专利权)人：广州普世利华科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44