一种快速检测解脲支原体的RDA方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种快速检测解脲支原体的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对解脲支原体（UU）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现解脲支原体的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明专利技术的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为解脲支原体的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测解脲支原体的RDA方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测解脲支原体核酸的引物对、探针及相关试剂盒。

技术介绍

[0002]解脲支原体（Ureaplasma urealyticum，UU）是介于细菌和病毒之间的病原微生物，无细胞壁、结构简单、能自行复制，直径仅有15～25um，是目前能独立在体外培养基中繁殖和生长的最小微生物。UU是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症等都有关系，是性传播疾病的病原体之一，是引起非淋菌性尿道炎和泌尿生殖系统感染的主要病原体。男性患者感染UU后，会出现前列腺炎和尿道炎等疾病，还会干扰精子的活动和代谢，减少精子的数量甚至导致精子畸形，使精子与卵子的结合能力降低引发不孕。女性患者感染UU后会出现起尿道炎、子宫内膜炎、输卵管炎、宫颈炎、盆腔炎等疾病。而且UU会破坏女性的输卵管粘膜，造成输卵管粘连或阻塞，使受孕的通道受阻导致不孕。早期筛查，及时诊断并尽量早期治疗，对预防解脲支原体的交叉感染及避免不育不孕等后遗症的发生具有重要意义。
[0003]目前UU检测实验室方法主要分为病原体检测（培养法）、免疫学检测和分子生物学法。液体培养基法是检测UU的经典方法，也是WHO推荐检测非淋菌性尿道炎的首选方法。该方法操作简单，对实验条件要求不高。但由于能分解尿素的细菌都可导致培养基颜色发生变化，例如流感嗜血杆菌、克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌等，故单纯依靠颜色的变化来判断会带来误判。固体培养法准确性非常好，但是这种方法操作繁琐，耗时长，对患者的检测带来不便，且临床研究表明其检测阳性率较低。因此，制约了其在UU检测临床上的应用。
[0004]分子生物学的检测大多基于PCR，检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，需配备专门的PCR实验室和专业操作人员，其成本和应用范围均受到一定限制。随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增 DNA。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 PCR 仪的依赖。若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有解脲支原体检测技术的缺陷和不足。研究得到一种解脲脲原体（UU）RDA荧光法检测试剂盒，实现解脲支原体（UU）的快速检测，在检测UU的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。
[0006]本专利技术目的在于，提供一组优选后的检测解脲支原体的探针及引物对。
[0007]所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。
[0008]优选地，采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 THF 位点的 5
’
端，另外至少 15 个位于其 3
’
端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。
[0009]所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1的探针，其5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代，其具体信息如下：UU-P1（SEQ ID NO .1）：5
’-
FAM-TGACC[THF]AAATGGTGTAGAACATGAGATAGA-BHQ1
ꢀ-
3'所述核苷酸序列为SEQ ID NO .2的探针，其5
’
端第30位碱基T标记FAM或者其他发光基团，第33位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第35位碱基标记BHQ1或者其他淬灭基团，3
’
端进行C3-spacer阻断修饰（SEQ ID NO .2）：UU-P2（SEQ ID NO .2）：5
’-
AATGTCAAAGGAATTGTTGTTGACCAAAA[FAM-dT]GG[THF]G[BHQ1-dT]AGAACATGAGATAGA[C3-spacer]ꢀ-3’
所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，所述靶标序列如SEQ ID NO .5所示，其具体信息如下：UU-F1（SEQ ID NO .3）： 5
’-ꢀ
GATAATGATG GAAATTTAGA AATTCACAC
ꢀ-3’
；UU-R1（SEQ ID NO .4）： 5
’-ꢀ
GGAATAATAA CCTTGCCATT AGCATCAA
ꢀ-3’
。
[0010]本专利技术另一个目的在于，提供一种基于恒温扩增技术的检测解脲支原体的试剂盒。
[0011]所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及所述的探针及所述的引物。
[0012]优选地，所述恒温扩增反应模块为恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂。
[0013]优选地， 所述恒温扩增反应混合试剂为RPA或重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）恒温扩增反应混合试剂。
[0014]本专利技术另一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）的检测解脲支原体的试剂盒。
[0015]重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）通过以下技术方案实现：本专利技术利用生物信息学方法，对批量的蛋白结构进行分析模拟和高通量虚拟筛选，并通过大量的生物学实验验证，最终找到了新的稳定性高的重组酶组合。具体地，本专利技术开发了一种新的重组酶组合为重组酶KX和辅助蛋白KY，所述重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，辅助蛋白KY的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0016]所述重组酶KX可以替代RPA反应中重组酶UvsX或RecA使用，所述KY蛋白可以替代RPA反应中UvsY蛋白使用。
[0017]重组酶KX与T4 U本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测解脲支原体的探针，其特征在于，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .2所示。2.如权利要求1所述的检测解脲支原体的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1的探针，其5
’
端标记发光基团，3
’
端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。3.如权利要求1所述的检测解脲支原体的探针，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO .2的探针，其5
’
端起第30位碱基T标记发光基团，第33位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第35位碱基标记淬灭基团，3
’
端进行C3-spacer阻断修饰。4.一组用于检测解脲支原体的靶标序列、引物对及探针，其特征在于，所述探针为权利要求1-3 任一所述探针，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，所述靶标序列如SEQ ID NO .5所示。5.一种检测解脲支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及权利要求1-3任一所述的探针及权利要求4所述的引物对。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的恒温扩增反应模块为RDA或RPA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂；所述RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组酶KX。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翀，谢婵芳，刘华勇，叶月娥，
申请(专利权)人：广州普世利华科技有限公司，
类型：发明
国别省市：