一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法技术

本发明专利技术公开了一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法。本发明专利技术研究得到一系列可用于检测常见猪传染病病原的特异性核酸序列位点，针对该位点开发了可实现猪传染病病原定性检测的检测技术，并构建了方便、快捷、成本低的猪传染病病原核酸检测方法和和检测试剂盒对猪传染病病原检测特异性好、灵敏度高，能够实现多位点同时检测，对猪常见传染病病原的快速检测、筛查、监控具有广阔的应用前景。

A Rapid Detection and Monitoring Method for Common Infectious Disease Pathogens in Pigs

【技术实现步骤摘要】
一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法
本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法。
技术介绍
猪常见传染病的病原分布广泛，具有很强感染性。随着农村生产结构的调整,养猪规模化程度的不断提高，生猪及其产品流通日益频繁，导致猪传染病疫情时常发生。加上部分生猪饲养密集区及猪场的检测防疫能力较弱，传染病一旦发生，若不能及时诊断和控制，将导致生猪大规模发病和死亡，给养猪户带来巨大的经济损失，也会大大增加整个社会在疫情防控中流通成本。为实现猪传染病的早期检测并控制其传播风险，开发低成本、准确、高效、快速地检测猪传染病病原的诊断方法显得尤为重要。常规的兽用病原检测技术如(1)分离培养技术：病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体检测的金标准。但该方法分离培养耗时长，无法实现短时间内迅速得到检测结果，必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对防疫站和养殖环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有猪传染病病原检测技术的缺陷和不足，研究得到一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现猪传染病病原的核酸检测，特异性好、灵敏度高，假阳性低。本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点及gRNA组合。本专利技术另一目的是提供一种针对猪传染病病原的CRISPR/Cas12a检测系统。本专利技术再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸的检测方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。所述猪传染病病原核酸检测靶标位点的序列如SEQIDNO.1-7任一所示。能特异性区分猪传染病病原的不同型别且包含Cas12a识别的PAM序列。同时所述靶标位点在作为猪传染病病原核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点方面的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。基于上述研究成果，本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原检测方法，是利用CRISPR/Cas12a系统检测上述靶标位点。具体是利用Cas12a蛋白和对应所述靶标位点的gRNA进行CRISPR核酸检测。所述gRNA以所述靶标位点为靶序列进行设计，设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。作为优选的可选择方案，所述gRNA靶向序列如SEQIDNO.8-23任一所示。同时本专利技术还提供一种猪传染病病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统或试剂盒，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA靶向序列对应于SEQIDNO.1-7任一所示靶标位点。优选地，所述gRNA靶向序列如SEQIDNO.8-23任一或任几个所示。另外，上述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白。比如LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a、AsCas12a等。所述ScCas12a的序列如SEQIDNO.24所示，所述SsCas12a的序列如SEQIDNO.25所示，所述LbCas12a的序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)，FnCas12a的序列参照Addgene号6-His-MBP-TEV-FnCpf1(Plasmid#90094)、AsCas12a的序列参照Addgene号AsCpf1-2NLS(Plasmid#102565)。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测靶标位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现猪传染病病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10-18摩尔/L)，实现靶标单分子检测。同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异，对于猪传染病病原的检测与筛查具有重要的意义。附图说明图1为实施例2中对非洲猪瘟病毒(ASFV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图2为实施例2中猪口蹄疫病毒(FMDV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图3为实施例2中对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图4为实施例2中对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图5为实施例2中对猪轮状病毒(PRV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图6为实施例4中对13例疑似感染非洲猪瘟病毒的临床样本的检测效果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。除非另有说明，本专利技术采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODSINENZYMOLOGY)系列(学术出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原检测方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas12a系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑7任一所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原检测方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas12a系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1-7任一所示。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用Cas12a蛋白和gRNA进行CRISPR核酸检测，所述gRNA以所述靶标位点为靶序列进行设计，设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述gRNA靶向序列如SEQIDNO.8-23任一或任几个所示。4.一种基于CRISPR/Cas12a技术的猪传染病病原核酸检测系统，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华勇，陈翀，谢婵芳，
申请(专利权)人：广州普世利华科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44