猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法，灭活前，两种病毒的含量均≥10

Binary inactivated vaccine against porcine epidemic diarrhea and porcine delta coronavirus and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法
本专利技术是中国专利技术专利“2017110873864猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法”的分案申请。本专利技术属于生物
，涉及一种动物二联灭活疫苗以及其制备方法，特别是指一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是以呕吐、腹泻和脱水为特征的猪肠道传染性疾病。主要是由PED病毒感染引起，该病毒主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口途径自然感染。各种年龄猪均易感，尤以哺乳仔猪最为严重，病死率最高可达100％。是影响全球养猪业的最重要病毒之一。猪δ冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)是一种新型冠状病毒，临床特征主要引起母猪和仔猪的急性水样腹泻。随着2012年PDCoV首次在香港猪粪便中检测到后，该病在全球不同地区陆续被发现。我国猪群PDCoV的感染也相当严重，部分地区猪群中腹泻病料样品中PDCoV阳性率超过25％。目前对于PDCoV，仍没有有效的治疗措施和疫苗。猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒均属于冠状病毒科病毒，抗原形态相似，这两种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上也极其相似，彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。由此可见，同时防控两种疾病显得尤为重要。目前PEDV、PDCoV等的混合感染而引起的疾病是全球养猪业的一大问题，对养猪业造成很大的损失。国内已有传染性胃肠炎和流行性腹泻二联疫苗，但是对于PDCoV，仍没有有效的治疗措施和疫苗，因此尽快研制出一种能够有效防治猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒的疫苗已成当务之急。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供由本专利技术人自行分离、保存的猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒，利用两种毒株制备猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗，用于防治猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒两种疾病。有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗，抗原成分在灭活前为猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒，其中，猪流行性腹泻病毒的含量≥107.0TCID50/mL、猪δ冠状病毒的含量≥107.0TCID50/mL。优选地，本专利技术的二联灭活疫苗是由猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒灭活后制备获得，灭活后各个抗原的体积比例为1:1。优选地，本专利技术的猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒的灭活是分别将病毒液按0.01mol/L的比例加入BEI，室温条件下以300r/min磁力搅拌灭活12小时，灭活后按0.7％的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30分钟后获得。优选地，本专利技术的二联灭活疫苗中含有佐剂，抗原与佐剂的质量比例为1:1。优选地，本专利技术的佐剂为MontanideISA206佐剂。本专利技术的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)猪流行性腹泻病毒液制备：将长满致密单层的Vero细胞，按0.2％剂量接种猪流行性腹泻病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；2)猪δ冠状病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按2％剂量接种δ冠状病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；3)当细胞病变在80％以上时，分别收获病毒，并反复冻融2次后，保存于-20℃以下，备用；4)对收获的病毒液进行病毒含量和无菌检验，将病毒含量在107.0TCID50/mL以上、无菌检验合格的病毒用于灭活；5)两种病毒液分别用BEI灭活，灭活检合格后，按照体积比例为1:1:1进行混合。6)与MontanideISA206佐剂按照质量比例为1:1乳化即可制成双相油乳剂联苗。优选地，本专利技术的二联灭活疫苗的制备方法中，所述的维持液为MEM培养基，含有100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。技术效果本专利技术通过提供了一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法，解决了目前市场上缺少有效的防治猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒病两种疾病联苗的问题，尤其是解决了近些年新流行的猪δ冠状病毒病没有疫苗的情况。该专利技术的二联灭活疫苗经济实用，免疫方法简单，有效地降低了防疫成本，为国内养殖企业同时预防两种疾病的发生提供了一种新的方法。附图说明图1猪流行性腹泻病毒接种到Vero上的病变图片。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。图2猪流行性腹泻病毒分离株PCR检测结果。图中，M：DNAMarkerDL2000；1：样品；2：阴性对照。图3猪δ冠状病毒接种到ST上的病变图片。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。图4猪δ冠状病毒分离株PCR检测结果。图中，M：DNAMarkerDL2000；1：样品；2：阴性对照。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1毒株的来源1、猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株将陕西某猪场采集、经RT-PCR检测为猪流行性腹泻抗原阳性的病料，按照1:10的比例(重量：体积)加入PBS，反复冻融3次后，离心取上清，经过0.22μm滤膜过滤两次，过滤液于-20℃以下保存备用。将长满致密单层的Vero细胞，按10％剂量接种过滤液，吸附后加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。传至第2代时出现明显细胞病变(图1)，第5代后病变基本稳定。应用PrimerPremier5.0基因分析软件，参照Genbank中PEDV的M蛋白基因设计检测引物对：上游引物PEDV-F：5’-AACGGTTCTATTCCCGTTGATG-3’；下游引物PEDV-R：5’-TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃45s、60℃45s、72℃45s进行35个循环后，72℃7min延伸。PEDV扩增片段为645bp。结果见图2。按现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。将分离的5代种毒命名为PEDV-KB2013-4株，其微生物保藏号是CGMCCNo.12663；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。2、猪δ冠状病毒SD株将山东某猪场采集、经RT-PCR检测为猪δ冠状病毒抗原阳性的病料，按照1:10的比例(重量：体积)加入PBS，反复冻融3次后，离心取上清，经过0.22μm滤膜过滤两次，过滤液于-20℃以下保存备用。将长满致密单层的ST细胞，按10％剂量接种过滤液，吸附后加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。传至第5代时出现明显细胞病变(图3)。第8代后病变基本稳定。应用PrimerPremier5.0基因分析软件，参照Genbank中PDCoV的M蛋白基因设计检测引物对：上游引物PDCoV-F：5’-CGCGTAATCGTGTGATCTATGT-3’；下游引物PDCoV-R：5’-CCGGCCTTTGAAGTGGTTAT-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃30s、56℃30s、72℃30s进行35个循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原成分在灭活前为猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒，其中，猪流行性腹泻病毒的含量≥10

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原成分在灭活前为猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒，其中，猪流行性腹泻病毒的含量≥107.0TCID50/mL、猪δ冠状病毒的含量≥107.0TCID50/mL。2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗是由猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒灭活后制备获得，灭活后各个抗原的体积比例为1:1。3.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒的灭活是分别将病毒液按0.01mol/L的比例加入BEI，室温条件下以300r/min磁力搅拌灭活12小时，灭活后按0.7%的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30分钟后获得。4.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中含有佐剂，抗原与佐剂的质量比例为1:1。5.根据权利要求4所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为MontanideISA206佐剂。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗，其中猪流行性腹泻病毒微生物保藏号是CGMCCNo.12663；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：董剑辉，陈瑞，张磊，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61