一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，所述无血清培养基由基础培养基，牛血清白蛋白，皮质醇，胰岛素，转铁蛋白，谷胱甘肽，胰蛋白酶，牛磺酸和亚硒酸钠组成，其中牛磺酸和亚硒酸钠的重量份配比比例为2‑3:1。该方法不添加动物血清，极大地降低了生产成本，提高了生产的经济效益，并且还避免了血清使用所带来的诸多问题。

【技术实现步骤摘要】
一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法
：本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法。
技术介绍
：猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性和高度传染性的肠道病毒性疾病,其症状包括腹泻，呕吐，厌食，脱水和仔猪体重减轻。虽然不同年龄段的猪都可能受到不同程度的感染并出现症状，但仔猪的病情特别严重，其中死亡率高达100％，PEDV主要通过小猪的肠粘膜表面进入宿主，主要导致肠上皮细胞损伤。虽然不同年龄段的猪都可能受到不同程度的感染并出现症状，但仔猪的病情特别严重，其中死亡率高达100％，PEDV主要通过小猪的肠粘膜表面进入宿主，主要导致肠上皮细胞损伤。针对PEDV的大爆发，我们通常可以采用疫苗策略来控制PEDV，并且在中国已经广泛开展了用杀死或减毒的PEDV疫苗进行疫苗接种，在一定程度上控制了PEDV的大规模爆发。但随着中国PEDV灭活或减毒二联疫苗的广泛使用，PED在全国范围内持续蔓延至2010年10月，当时出现变异株，PEDV感染急剧增加，严重危害养猪业。虽然国内用于流行性腹泻的疫苗（包括二联灭活苗及二联活疫苗）得到了广泛的推广和应用，并且在一定范围和程度上减少了猪流行性腹泻的发病率，但是该病仍然未能得到完全控制，尤其在2010年10月至今，该病呈持续性，爆发性增长趋势。通常，PEDV采用vero细胞进行培养和增殖，进而灭活制备得到PEDV灭活疫苗。目前，基于vero细胞培养PEDV疫苗的生产过程多采用两阶段操作工艺，即：前期在有血清的培养基中使细胞增殖至所需密度；后期通过洗涤去除血清成分及代谢废物，更换为低血清或无血清培养基以支持病毒在细胞中感染和复制。然而，现有疫苗生产中，前期vero细胞的培养液以商业化的培养基配合小牛或者马血清进行培养和生产。血清组分的复杂性和不确定性及批次间的差异增加了疫苗等细胞产品生产及质量控制的难度，同时血清易引起细菌、真菌、病毒及支原体的污染，增加了疫苗生产的安全性隐患。并且血清本身价格也比较昂贵，这些均使得血清在PEDV疫苗的生产和研究中的应用存在诸多不利。实践已证明无血清培养基不仅能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷,也能取得较好的培养效果。并且由于其明确的成分组成,可避免血清的不同批次或不明组分对细胞培养及试验研究的影响,从而提高结果的可重复性。因此,基于PEDV疫苗生产中血清使用所存在的诸多问题以及生产成本高昂，因此，尽量减少血清的用量一直是疫苗生产中研究的课题，低血清以及无血清培养基的开发和应用势在必行。
技术实现思路
：为解决以上技术问题，及现有技术中血清使用所存在的诸多问题以及生产成本高昂，本专利技术旨在提供一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，该培养基不添加动物血清，极大地降低了生产成本，提高了生产的经济效益，并且还避免了血清使用所带来的诸多问题。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：步骤（1），Vero细胞的复苏；步骤（2），Vero细胞的传代扩增；步骤（3），在Vero细胞上接种PEDV病毒毒株；步骤（4），收获感染细胞培养上清液，病毒液进行澄清过滤；步骤（5），灭活，即制备得到PEDV灭活疫苗；其中步骤（2）中的传代扩增和步骤（3）中病毒的增殖过程均采用本专利技术的无血清培养基。所述无血清培养基由基础培养基，牛血清白蛋白，皮质醇，胰岛素，转铁蛋白，谷胱甘肽，胰蛋白酶，牛磺酸和亚硒酸钠组成，其中牛磺酸和亚硒酸钠的重量份配比比例为2-3:1。所述的无血清培养基中：所述的基础培养基IMDM（Giboc）或者是RPMI-1640，或者是二者的混合物；所述的牛血清白蛋白的含量为8-15mg/mL；所述的皮质醇的含量为15-25μg/mL；所述的胰岛素的含量为10-20μg/mL；所述的转铁蛋白的含量为10-15μg/mL；所述的谷胱甘肽的含量为2-3mM；所述的胰蛋白酶的含量为3-5μg/mL；所述的牛磺酸的含量为20-30μg/mL；所述的亚硒酸钠的含量为10-12μg/mL。优选的，所述的无血清培养基中：所述的基础培养基IMDM（Giboc）或者是RPMI-1640，或者是二者的混合物；所述的牛血清白蛋白的含量为10mg/mL；所述的皮质醇的含量为20μg/mL；所述的胰岛素的含量为20μg/mL；所述的转铁蛋白的含量为15μg/mL；所述的谷胱甘肽的含量为3mM；所述的胰蛋白酶的含量为4μg/mL；所述的牛磺酸的含量为20μg/mL；所述的亚硒酸钠的含量为10μg/mL。所述的无血清培养基的制作方法是：步骤一，按重量份称取基础培养基干粉、牛血清白蛋白，皮质醇，胰岛素，转铁蛋白，谷胱甘肽，胰蛋白酶，牛磺酸和亚硒酸钠；步骤二，将称取的以上物质混合后，加超纯水至1000mL，搅拌溶解，调节pH值至7.0-7.2，而后采用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保藏。本专利技术还涉及利用本专利技术所述的无血清培养基培养PEDV病毒的方法，所述方法包括如下步骤：步骤（1），Vero细胞的复苏；步骤（2），Vero细胞的传代扩增；步骤（3），在Vero细胞上接种PEDV病毒毒株；步骤（4），收获感染细胞培养上清液，病毒液进行澄清过滤，即得到所述的PEDV病毒液；其中步骤（2）中的传代扩增和步骤（3）中病毒的增殖过程均采用本专利技术的无血清培养基。基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术的实施例1和实施例2的培养基均对PEDV的增殖具有较好的增殖效果，其相比现有常用的小牛血清加DMEM培养基，更能促进PEDV的增殖，其增殖的病毒滴度明显升高，表明本专利技术的培养基可以替代传统的含血清培养基用于PEDV的增殖和疫苗的制备，从而避免了疫苗生产过程中血清的使用所导致的免疫问题；其与本专利技术设置的对照实验组相比，进一步验证了谷胱甘肽的添加以及牛磺酸与亚硒酸钠的比例对于PEDV细胞增殖的重要性，对比试验例1中未添加谷胱甘肽，且牛磺酸与亚硒酸钠的比例也存在差异，高于本专利技术，则其病毒增殖效果较本专利技术差；对比试验例2中牛磺酸与亚硒酸钠的比例为1：1，即牛磺酸使用不足，则导致病毒增殖不及预期，虽然其在0-12h阶段增殖较快，但是在病毒增殖后期的滴度上升较慢；对比试验例3中未添加谷胱甘肽，则病毒增殖不及预期，其早期增殖相对较慢，后期增殖也略显不足。以上试验结果表明，本专利技术的培养基中，谷胱甘肽的添加以及牛磺酸与亚硒酸钠的比例对于PEDV细胞增殖的具有重要的意义，两者在病毒增殖培养中协同增效，取得了预料不到的培养效果。附图说明：图1：PEDV病毒培养的情况。A，对照组，正常的vero细胞；B，接毒24小时后，与对照组的正常细胞相比，出现较为明显的CPE；C，接毒48小时后，细胞变圆，有部分细胞漂浮脱落，出现拉网状等病理变化。图2：IFA检测结果：A是正常的vero细胞对照；B是采用本专利技术实施例1培养基进行培养后的IFA检测结果；C是采用10%FBSDMEM细胞培养液进行培养后的IFA检测结果，D是采用以下对照试验例所展示的培养基进行培养的IFA检测结果。具体实施方式：实施例1：一种适合大规模生产PEDV疫苗的无血清培养基，其特征在于，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：步骤（1），Vero细胞的复苏；步骤（2），Vero细胞的传代扩增；步骤（3），在Vero细胞上接种PEDV病毒毒株；步骤（4），收获感染细胞培养上清液，病毒液进行澄清过滤；步骤（5），灭活，即制备得到PEDV灭活疫苗；其中步骤（2）中的传代扩增和步骤（3）中病毒的增殖过程均采用本专利技术的无血清培养基。

【技术特征摘要】
1.一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：步骤（1），Vero细胞的复苏；步骤（2），Vero细胞的传代扩增；步骤（3），在Vero细胞上接种PEDV病毒毒株；步骤（4），收获感染细胞培养上清液，病毒液进行澄清过滤；步骤（5），灭活，即制备得到PEDV灭活疫苗；其中步骤（2）中的传代扩增和步骤（3）中病毒的增殖过程均采用本发明的无血清培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基由基础培养基，牛血清白蛋白，皮质醇，胰岛素，转铁蛋白，谷胱甘肽，胰蛋白酶，牛磺酸和亚硒酸钠组成，其中牛磺酸和亚硒酸钠的重量份配比比例为2-3:1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的无血清培养基中：所述的基础培养基IMDM（Giboc）或者是RPMI-1640，或者是二者的混合物；所述的牛血清白蛋白的含量为8-15mg/mL；所述的皮质醇的含量为15-25μg/mL；所述的胰岛素的含量为10-20μg/mL；所述的转铁蛋白的含量为10-15μg/mL；所述的谷胱甘肽的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜恩岐，陈瑞，刘项羽，左文峰，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61