人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法。该无血清培养基为DMEM/F12基础培养基中添加人表皮细胞生长因子、人转铁蛋白、人胰岛素、亚硒酸钠、丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸；其培养方法是将人羊膜用2.5g/L胰蛋白酶消化，获取人羊膜上皮干细胞，并将其过滤制成单细胞悬液；再通过上述无血清培养基，使人羊膜上皮干细胞在无血清条件下，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO

【技术实现步骤摘要】
人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法
本专利技术属于生物
的一种上皮细胞培养基及其培养方法，具体涉及的是一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法。
技术介绍
人羊膜易于获得，具有不引起伦理学争议、所含羊膜干细胞（羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞）含量丰富、免疫原性低等特点,可成为再生医学临床应用的重要种子细胞来源。人羊膜上皮干细胞（amnioticepithelialstemcells,AESCs）是由羊膜分离获得的干细胞之一。hAESC分化于原始的二胚层胚盘，是受精后第8天由外胚层细胞发育而来，早于三胚层胚胎的形成，这一独特的组织胚胎学来源赋予了hAESC多向分化的潜能和独特的干细胞样特性。目前已可将其分化为神经细胞和脂肪细胞等。由于其不表达HLA-A，B,C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反应；又因其缺少端粒酶，不能形成崎胎瘤，因此，对人羊膜上皮细胞培养方法的探索及生长特性的研究具有重要意义。目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的胎牛血清或新生小牛血清。由于上述异种动物血清存在动物携带的已知或未知病原体，因此，限制了干细胞的临床应用。无血清细胞培养技术为干细胞的无血清培养提供了可能。虽然已有专利技术专利羊膜间充质干细胞无血清培养基（专利号CN201010252201.2），但由于上皮干细胞与间充质干细胞属于不同类别的干细胞，故需要的培养条件和需要的无血清细胞培养基也不同；因此还需要进行创新和改进以克服其局限性，由于hAESCs不合成端粒酶，hAESCs植入体内，并不形成畸胎瘤，在干细胞应用的安全性方面较一般干细胞更具临床应用潜力。增强了临床应用的安全性，使其用途更具优势。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术存在的问题而提供一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法，本专利技术解决了上皮干细胞培养存在异种血清的问题，不形成畸胎瘤，应用安全，同时也解决了同种异体、来源广泛、不受伦理限制及无免疫原性问题。本专利技术人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：DMEM／F12(按体积1:1混合)15.0～15.6g/L表皮细胞生长因子0.005～0.015mg/L人转铁蛋白1.0～7.0mg/L人胰岛素5.5～15mg/L亚硒酸钠5.0～7.2×103mg/LL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500mg/LL-丙氨酸10～25mg/LL-天冬酰胺4.9～10.9mg/LL-天冬氨酸9.3～17.3mg/LL-谷氨酸10.7～18.7mg/L甘氨酸5.5～8.5mg/LL-脯氨酸7.5～15.5mg/LL-丝氨酸6.5～11.5mg/L本专利技术人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备取人羊膜先用终浓度2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30分钟～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目～300目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～15分钟，用PH7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟～2500转/分钟，时间为15分钟～35分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增将第(1)步所得细胞接种于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行传代培养，每24小时～48小时全量换液一次，使人羊膜上皮干细胞通过换液和传代逐渐得到扩增和纯；。所述人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：DMEM／F12（按体积1:1混合）15.0～15.6g/L表皮细胞生长因子0.005～0.015mg/L人转铁蛋白1.0～7.0mg/L人胰岛素5.5～15mg/L亚硒酸钠5.0～7.2×103mg/LL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500mg/LL-丙氨酸10～25mg/LL-天冬酰胺4.9～10.9mg/LL-天冬氨酸9.3～17.3mg/LL-谷氨酸10.7～18.7mg/L甘氨酸5.5～8.5mg/LL-脯氨酸7.5～15.5mg/LL-丝氨酸6.5～11.5mg/L在上述第(2)步中，择优选择将第(1)步所得细胞以2.5×l07L-1～2.5×l010L-1密度接种于上述无血清培养基中培养；细胞扩增和纯化的过程如下：将第(2)步所得细胞于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每24小时～48小时全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每24小时～48小时全量换液1次，直至细胞贴壁彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P1代，继续上述传代培养过程，使人羊膜上皮干细胞逐渐得到扩增和纯化。本专利技术的优点在于：人羊膜是胎儿出生后随胎盘排出体外，并作为“废弃物”丢弃，本专利技术在体外取羊膜提取人羊膜上皮干细胞，并进行无血清培养，与用含有胎牛血清的培养基培养人羊膜上皮干细胞进行比较，具有无其他动物源性、不受伦理限制及异种免疫原性等优越性。由于不合成端粒酶，hAESCs植入体内不形成畸胎瘤，在干细胞应用的安全性方面较一般干细胞更具临床应用潜力。适宜于不同个体之间的移植，是细胞治疗的理想靶细胞。具有比骨髓干细胞更强的扩增能力和免疫原性及成瘤性更低等骨髓干细胞无法比拟的优点。本专利技术与骨髓间充质干细胞比较，克服了骨髓间充质干细胞的取材困难及年龄等局限性，其临床应用的安全性和用途更具优势，具有经济实用性和广泛普及性，临床应用性更强。附图说明图1为原代培养hAESCs倒置显微镜（×40）的示意图。图2为细胞免疫荧光方法检测提取培养原代（P0）代hAESCs中上皮标志物上皮角蛋白CK19（×100）和间质细胞标志物波形蛋白（×100）表达的示意图。图3为无血清培养基培养P1代hAESCs培养96小时倒置显微镜（×40）的示意图。图4为含10%胎牛血清完全培养基培养P1代hAESCs培养96小时倒置显微镜（×40）的示意图。图5为流式细胞分析技术鉴定无血清培养基培养96小时hAESCs中分化抗原簇（clusterofdifferentiation，简称CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR的表达的示意图。图6为流式细胞分析技术鉴定含10%胎牛血清培养基培养96小时hAESCs中分化抗原簇（clusterofdifferentiation，简称CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR的表达的示意图。图7为MTS增殖检测分析检测无血清培养基与含10%FBS的培养基培养hAESCs细胞增殖能力的示意图。图8为细胞免疫荧光方法检测体外诱导hAESCs向胰岛素分泌细胞分化特异性标志物Insulin、Glucagon、PPY和Mafa基因（×100）表达的示意图。图9为实时定量PCR方法检测无血清培养基培养的hAESC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：DMEM／F12按体积1:1混合15.0～15.6g/L表皮细胞生长因子0.005～0.015 mg/L人转铁蛋白1.0～7.0 mg/L人胰岛素5.5～15 mg/L亚硒酸钠5.0～7.2×10

【技术特征摘要】
1.一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：DMEM／F12按体积1:1混合15.0～15.6g/L表皮细胞生长因子0.005～0.015mg/L人转铁蛋白1.0～7.0mg/L人胰岛素5.5～15mg/L亚硒酸钠5.0～7.2×103mg/LL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500mg/LL-丙氨酸10～25mg/LL-天冬酰胺4.9～10.9mg/LL-天冬氨酸9.3～17.3mg/LL-谷氨酸10.7～18.7mg/L甘氨酸5.5～8.5mg/LL-脯氨酸7.5～15.5mg/LL-丝氨酸6.5～11.5mg/L。2.一种人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备取人羊膜先用终浓度2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30分钟～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目～300目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～15分钟，用PH7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟～2500转/分钟，时间为15分钟～35分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增将第(1)步所得细胞接种于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行传代培养，每24小时～48...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞希宁，施萍，赵峰，郎宏鑫，
申请(专利权)人：庞希宁，
类型：发明
国别省市：辽宁,21