一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。本发明专利技术提供的复苏培养基的制备方法为：取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。采用本发明专利技术羊膜间充质干细胞的复苏培养基进行羊膜间充质干细胞的复苏培养，有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，特别涉及一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。
技术介绍
神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一类由于中枢神经系统被阻断，导致神经元细胞功能丧失，从而使中枢神经系统功能被抑制的疾病，具有发病率高、死亡率高的特点，主要包括：脑中风、脑外伤、脊髓性肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病以及帕金森病等。神经退行性疾病均会引发较为严重的症状。其中，脑中风是因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂而造成急性脑血液循环障碍的一种疾病，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征；脊髓性肌肉萎缩症是最常见的致死性神经肌肉疾病之一，是由于脊髓前角细胞运动神经元变性，导致患者近端肌肉对称性、进行性萎缩和无力，最终导致呼吸衰竭甚至死亡的一种疾病；阿尔茨海默病是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征；帕金森病主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍。研究表明，老龄是诱发该类疾病最主要的危险因素之一。随着老龄化社会的到来，神经系统退行性疾病的发病率呈逐年上升趋势。据估计，目前全球阿尔茨海默病患者约9200万，帕金森病患者约2300万，运动神经元病患者约46万。仅在美国，就有500万阿尔茨海默病患者，100万帕金森病患者。神经退行性疾病给人类健康和生命造成极大威胁，给患者带来极大痛苦，给家庭及社会带来沉重的负担，因此，充分认识神经退行性疾病的严重性，提高对该类疾病的治疗与预防水平是当务之急。目前治疗此类疾病的药物虽然很多，但是除帕金森病患者通过合理用药可延长其寿命和改善其生活质量外，对其他神经退行性疾病的治疗效果均不理想。因此开发新型的治疗神经退行性疾病的药物迫在眉睫。研究表明人羊膜上皮细胞具有神经生物学功能，与神经干细胞具有同源性。神经干细胞(neural stem cell，NSC)研究虽起步较晚，但却是当前研究的热点。由于成体神经组织内NSC数量少，分散分布，取材困难，无免疫原性NSC细胞系建立困难以及异体移植存在的免役排斥问题等原因，使NSC在神经系统疾病治疗中的应用受到一定的限制。随着对羊膜上皮细胞具有神经干细胞特性的研究逐步深入，羊膜干细胞为治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤将会带来新的契机。Kakishita等在证实培养HAEC中含酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞的基础上，利用HAEC可以合成多巴胺的特点，进行大鼠脑内移植HAEC治疗帕金森病(PD)动物模型的实验，结果显示，移植2周后，大鼠脑内有人源性TH阳性细胞的存活，并可释放DA，有效地改善了大鼠PD症状。Kakishita等进一步于体外实验证实HAEC通过分泌的可溶性营养因子增强多巴胺能神经元的生存，移植到PD大鼠模型脑内的HAEC也可能通过细胞因子作用阻止多巴胺能神经元的丧失。Okawa等以大鼠羊膜上皮细胞作为供体细胞移植于缺血性脑损伤的海马，5周后发现增生的细胞迁移至CAl区锥体层，神经元细胞选择性存活于CAl区锥体层，表明羊膜细胞具有治疗脑损伤的潜力。在羊膜干细胞的临床应用中涉及到羊膜干细胞的冻存、复苏技术，细胞复苏是将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征。目前，通常采用普通商品化的完全培养基对羊膜干细胞进行复苏培养。但普通商品化的完全培养基在细胞的复苏过程中无法保证干细胞的活力，细胞增值率较低，影响干细胞的临床利用。因此，需要开发一种能够更好地维持羊膜间充质干细胞活力的复苏培养基及其复苏方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。该复苏培养基能够更好地维持羊膜间充质干细胞的活力。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基，该复苏培养基的制备方法为：取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。作为优选，第一培养的时间为24～72h。在本专利技术提供的一些实施例中，第一培养的时间为24h。在本专利技术提供的一些实施例中，第一培养为在37℃、5％CO2条件下培养。作为优选，第一培养的羊膜间充质干细胞的接种密度为(5～10)×103cell/cm2。优选地，第一培养的羊膜间充质干细胞的接种密度为7×103cell/cm2。作为优选，无血清培养基为DMEM/F12培养基。作为优选，第二培养的时间为24～72h。在本专利技术提供的一些实施例中，第二培养的时间为24h、48h或72h。在本专利技术提供的一些实施例中，第二培养为在37℃、5％CO2条件下培养。作为优选，收集上清液后还包括离心的步骤。作为优选，离心为1000～2000rpm离心5～10min。在本专利技术提供的一些实施例中，离心为1000rpm离心5min。作为优选，离心后还包括过滤除菌的步骤。在本专利技术提供的一些实施例中，用于过滤除菌的滤膜的孔径为0.22μm。本专利技术还提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养方法，采用本专利技术的复苏培养基复苏培养冻存的羊膜间充质干细胞。作为优选，本专利技术提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养方法为：取冻存的羊膜间充质干细胞，经温育后，采用本专利技术复苏培养基复苏培养温育后的羊膜间充质干细胞。优选地，本专利技术提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养方法为：取冻存的羊膜间充质干细胞，在35～42℃下震荡温育30～60s，加入5～10倍体积的本专利技术复苏培养基，离心，去上清，按(5～10)×103cell/cm2的密度接种于本专利技术复苏培养基，在37℃、5％CO2条件下培养24h，获得第一复苏羊膜间充质干细胞；然后按(5～10)×103cell/cm2的密度将第一复苏羊膜间充质干细胞接种于本专利技术复苏培养基，在37℃、5％CO2条件下继续培养24～48h，获得复苏后的羊膜间
充质干细胞。在本专利技术提供的一些实施例中，本专利技术提供的羊膜间充质干细胞的复苏培养方法为：取冻存的羊膜间充质干细胞，在42℃下震荡温育60s，加入5倍体积的本专利技术复苏培养基，离心，去上清，按7×103cell/cm2的密度接种于本专利技术复苏培养基，在37℃、5％CO2条件下培养24h，获得第一复苏羊膜间充质干细胞；然后按7×103cell/cm2的密度将第一复苏羊膜间充质干细胞接种于本专利技术复苏培养基，在37℃、5％CO2条件下继续培养48h，获得复苏后的羊膜间充质干细胞。本专利技术提供了一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基及其复苏培养方法。该复苏培养基的制备方法为：取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。本专利技术的有益效果为：用羊膜间充质干细胞的条件培养基进行羊膜间充质干细胞的复苏培养，有利于羊膜间充质干细胞复活活力的提高与细胞增殖，能够更好的保持羊膜间充质干细胞的生物学特征。附图说明图1示实施例1复苏后细胞活力检测结果；图2示实施例1中试验组的复苏后的羊膜间充质干细胞的流式检测结果；其中图2-1示CD73检测结果，图2-2示CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基，其特征在于，所述复苏培养基的制备方法为：取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。

【技术特征摘要】
1.一种羊膜间充质干细胞的复苏培养基，其特征在于，所述复苏培养基的制备方法为：取羊膜间充质干细胞，采用完全培养基进行第一培养后，再采用无血清培养基进行第二培养后，收集上清液，获得复苏培养基。2.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第一培养的时间为24～72h。3.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第一培养的羊膜间充质干细胞的接种密度为(5～10)×103cell/cm2。4.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述无血清培养基为DMEM/F12培养基。5.根据权利要求1所述的复苏培养基，其特征在于，所述第二培养的时间为24～72h。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，冯德龙，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44