一种外泌体冻存保护液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种外泌体冻存保护液及其制备方法。该外泌体冻存保护液包括：含NaCl、KCl的Tris‑HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD‑Lipid浓缩液、人血清白蛋白溶液、聚乙烯醇。本发明专利技术提供的外泌体冻存保护液的配比合理，成分简单，组成明确，加入所述冻存保护液的外泌体能在‑20℃的低温条件下，稳定保存6‑12个月，其生物学活性能维持其最大活性的90％；本发明专利技术冻存保护液中所有组分的构成明确，可以工业化生产，原材料价格便宜、易获取，具有低成本优势。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体冻存保护液及其制备方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种外泌体冻存保护液及其制备方法。
技术介绍
干细胞分泌的外泌体是直径在30-150nm的囊泡，由与细胞质膜相同的脂质双分子层包裹，内部含有蛋白质和RNA等生物活性物质。间充质干细胞(MSCs)以旁分泌方式发挥作用，其机制为干细胞通过产生大量细胞因子和生长因子，以及产生外泌体(exosomes)来起到组织修复的作用。目前干细胞广泛应用于组织修复及缺血性疾病治疗领域。研究发现，干细胞分泌的外泌体能模拟干细胞的生物学功能，也逐渐被证实能促进组织修复和治疗一些难治性疾病，具有广阔的应用前景。与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释。因为干细胞外泌体作为治疗产品具有干细胞制剂不具有的某些特性，例如外泌体相比活细胞而言，成分比较确定，易于质量控制，因此这些特性使得外泌体具有很大的应用价值。越来越多的研究表明，干细胞外泌体可减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学作用。外泌体的这些作用使得其在治疗心肌梗死、皮肤创伤等组织损伤中存在良好的应用前景。外泌体的稳定性低、容易失活，为了维持外泌体的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。外泌体生物活性的丧失多发生在贮存保藏阶段，一般制成液体制剂超低温(例如不高于-60℃)下保存，在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。而在冷冻点以下的温度保存稳定的主要挑战之一就是防止结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。另外，超低温保存的时间过长在使用过程中反复冻融或者使用不当，外泌体的生物活性往往会迅速大幅下降，从而限制了它的正常使用。现有技术中通常通过添加冻存保护剂来保存外泌体的活性，例如培养基或牛血清，但在培养基中冻存3个月内的外泌体的活性急剧下降，牛血清保存的外泌体中还存在潜在的致病因子，并造成外泌体批间稳定性不一致。也有针对外泌体设计的冻干制剂方法，这类试剂虽能一定程度上保存外泌体的活性，但试剂的成份复杂，制备较繁琐，并不利于外泌体制剂质量的控制。因此亟需一种成分简单、能在较低温下长期保存外泌体且不影响其活性的冻存保护试剂及方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种外泌体冻存保护液及其制备方法。该外泌体冻存保护液成分简单、能在较低温下长期保存外泌体，且不影响其活性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种外泌体冻存保护液，外泌体冻存保护液包括：含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD-Lipid浓缩液、人血清白蛋白(HSA)溶液、聚乙烯醇(PVA)。作为优选，以重量份计，外泌体冻存保护液中各组分的用量为：优选地，以重量份计，外泌体冻存保护液中各组分的用量为：作为优选，含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液中，Tris-HCl的摩尔浓度为10～50mM，NaCl的摩尔浓度为80～200mM，KCl的摩尔浓度为1～5mM；含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0～8.0。优选地，含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液中，Tris-HCl的摩尔浓度为25mM，NaCl的摩尔浓度为137mM，KCl的摩尔浓度为2.5mM；含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.4。本专利技术还提供了该外泌体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：将NaCl、KCl加入到Tris-HCl缓冲溶液中，得到含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液；将含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液、葡萄糖、聚乙烯醇、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白溶液混合，制得外泌体冻存保护液。作为优选，混合之前还包括将各组分采用滤膜进行过滤的操作。作为优选，滤膜的孔径为0.2～0.3μm。优选地，滤膜的孔径为0.22μm。本专利技术提供了一种外泌体冻存保护液及其制备方法。该外泌体冻存保护液包括：含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD-Lipid浓缩液、人血清白蛋白溶液、聚乙烯醇。本专利技术具有的技术效果为：本专利技术提供的外泌体冻存保护液的配比合理，成分简单，组成明确，加入所述冻存保护液的外泌体能在-20℃的低温条件下，稳定保存6-12个月，其生物学活性能维持其最大活性的90％；本专利技术冻存保护液中所有组分的构成明确，可以工业化生产，原材料价格便宜、易获取，具有低成本优势。附图说明图1采用本专利技术外泌体保护液保存12个月后的外泌体粒径分布与数量；图2采用本专利技术外泌体保护液保存12个月后的外泌体形态图；图3采用不同外泌体保护液保存12个月后外泌体促细胞增殖活力比较。具体实施方式本专利技术公开了一种外泌体冻存保护液及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。术语解释：外泌体(Exosome)：一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30-150nm，具有脂质双层膜结构，携带RNA和蛋白质，被大多数细胞类型释放，是细胞间通讯系统的一部分。几乎所有的细胞都会分泌胞外囊泡，包括间充质干细胞，间充质干细胞来源的胞外囊泡含有与母细胞相似的成分，如细胞因子、生长因子、脂类、mRNAs及调控型miRNAs等。他们主要参与细胞与细胞间的交流通讯及改变组织的微环境等，在免疫调控，组织损伤修复等方面起着不可低估的作用。干细胞来源外泌体：间充质干细胞不仅能分泌一些可溶性生物活性因子，亦可分泌胞外微囊泡，促进血管再生，抑制细胞凋亡及纤维化，进而促进损伤组织修复再生。越来越多的研究表明，间充质干细胞来源的胞外囊泡在组织损伤修复和器官功能恢复过程中起着非常重要的作用，因此，胞外囊泡有望取代细胞治疗，成为一种安全有效的无细胞治疗药剂。外泌体保存：制备好的外泌体一般以液体形式，使用PBS、培养基、血清作为溶剂，放在-20℃低温保存，稳定性差，容易失活。本专利技术提供的外泌体冻存保护液及其制备方法中所用原料药或辅料均可由市场购得。CD-Lipid浓缩液、人血清白蛋白溶液、聚乙烯醇分别购自Gibco、杰特贝林、sigma公司。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1外泌体保存制剂及其制备方法本实施例外泌体保存制剂配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体冻存保护液，其特征在于，包括：含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD-Lipid浓缩液、人血清白蛋白溶液、聚乙烯醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种外泌体冻存保护液，其特征在于，包括：含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD-Lipid浓缩液、人血清白蛋白溶液、聚乙烯醇。


2.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，以重量份计，外泌体冻存保护液中各组分的用量为：





3.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，以重量份计，外泌体冻存保护液中各组分的用量为：





4.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液中，Tris-HCl的摩尔浓度为10～50mM，NaCl的摩尔浓度为80～200mM，KCl的摩尔浓度为1～5mM；所述含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0～8.0。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述含NaCl、KCl的Tr...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王小燕，姜交华，刘志敏，陈东煌，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，广东国科细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44