一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种可以用来维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，包括小鼠上胚层干细胞在本发明专利技术培养条件下的获取、传代和培养，以及对本发明专利技术条件下培养的小鼠上胚层干细胞自我更新状态进行观察与检测。本发明专利技术方法解决了传统培养条件下细胞状态不稳定、传代操作不方便以及现有培养条件成本高、作用因子复杂和不利于后续探究等问题，具有经济高效、操作便捷、效果稳定、利于研究等优点，而且可以为改善目前人胚胎干细胞以及其他种类多能性干细胞的培养条件提供线索，对于促进干细胞基础与应用研究的顺利开展具有重要作用。

Culture method for maintaining self-renewal state of mouse embryonic stem cells

The invention discloses a can be used to maintain mouse epiblast stem cell culture method of self renewal, including stem cells in the ectoderm culture conditions to obtain, passaged and cultured in mice, and the invention of cultured mouse epiblast stem cell self-renewal state observation and detection. The method of the invention solves the problems of the traditional culture under the condition of cell state is not stable, the operation is not convenient passage and existing culture conditions of high cost, complex factors and is not conducive to the subsequent inquiry, with high efficiency, convenient operation, stable effect, to study the advantages, but also can improve the current human embryonic stem cells and other species stem cell culture conditions can provide clues, plays an important role in promoting the basis and application of stem cells carried out smoothly.

【技术实现步骤摘要】
一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法
本专利技术属细胞培养领域，尤其涉及一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法。
技术介绍
干细胞是分离自早期胚胎的一类细胞，在体外培养条件下具有无限增殖(自我更新)的能力，同时还保持着分化为机体各种类型细胞的潜能(分化)，现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一，在再生医学领域具有巨大的应用前景。目前研究得最为广泛的干细胞是小鼠胚胎干细胞(mouseEmbryonicStemCells，mESCs)，这也是第一株在体外成功建立的干细胞系。其后，人胚胎干细胞(humanEmbryonicStemCells，hESCs)系也得以成功构建。小鼠与人ESCs虽然拥有一些共同的特征，但二者的生物学特性却有诸多不同之处。值得关注的是，科学家们于2007年从小鼠着床后的囊胚中分离得到了一种新型的干细胞——上胚层干细胞(mouseEpiblastStemCells，mEpiSCs)。mEpiSCs与mESCs在生物学特性上存在较大差异，却与hESCs具有许多相似之处。由于人源性，hESCs无法进行嵌合体实验或其它涉及伦理道德问题的研究，而mEpiSCs则可充当相应空白领域的补充材料；对mEpiSCs的深入研究，可为hESCs提供有利的研究思路与方法，其本身也是对于整个干细胞领域探究深度与广度的扩充，因而具有重要的科研价值与学术意义，相关成果有助于未来对于干细胞的安全应用。开展各类研究的前提是对于实验材料的获取与维持。早期分离得到的mEpiSCs被培养在人工合成培养基(chemicallydefinedmedium，CDM)中，并加入细胞因子激活素A(ActivinA)和成纤维细胞生长因子2(fibroblastgrowfactors-2，FGF2)来维持细胞的生长与自我更新状态。在CDM/AF条件下培养的mEpiSCs虽然也能表达自我更新标志基因并维持40代以上，但细胞的生长速度比较缓慢，不能耐受单细胞消化，易凋亡，需使用手动切割的方法，以小团块形式进行传代，此种方法不仅对操作人员的要求较高，操作过程中也容易造成细胞的污染，因此，常规培养方法不仅耗时、费力，且传代后的细胞存活力低、容易分化，大大地限制了其基础和应用研究。为了优化小鼠上胚层干细胞的培养条件，现安徽大学干细胞与转化医学研究中心的叶守东博士通过一个小分子化合物库，筛选出Wnt/β-catenin信号通路的一个小分子抑制剂IWR1能够有效地提高mEpiSCs的自我更新能力，大大地改善了目前mEpiSCs的培养状况。此外，通过查阅相关科研进展，发现ROCK激酶的抑制剂Y27632可以提高hESCs的存活率。鉴于hESCs与mEpiSCs之间生物学特征的相似性，遂也可以将Y27632应用于mEpiSCs的培养中。优化后的培养条件以10％FBS含量的DMEM培养基为基础，加入ActivinA、bFGF、IWR1以及Y27632这四种细胞因子或小分子化合物。在此种培养条件下，细胞可耐受胶原酶IV的消化处理，存活能力显著提高，克隆形态均一，生长状况良好，可多次传代，不出现分化现象。虽然优化后的ActivinA+bFGF+IWR1+Y27632培养条件可以维持mEpiSCs的生长与自我更新状态，但由于所涉及的细胞因子种类过多，不利于后续对于细胞内相关信号通路与分子机制的深入探究，且培养成本高。本专利技术在此基础上，通过逐个递减与对不同排列组合的尝试，进一步改进与优化mEpiSCs的培养条件，优化后的条件仅使用两种小分子即可维持mEpiSCs的自我更新状态，达到与原培养条件相同的培养效果，具有省时、省力、省钱、利于后续研究等优点。
技术实现思路
为了解决传统培养条件中出现的细胞状态不稳定、传代操作不方便以及现有培养条件成本高、作用因子复杂和不利于后续探究等问题，本专利技术提供了一种经济高效、操作便捷、效果稳定、利于开展后期研究的小鼠上胚层干细胞培养条件。上述目的通过以下方案实现：本专利技术的技术方案是在含10％FBS的DMEM培养基基础上，通过加入IWR1和Y27632两种小分子化合物来维持小鼠上胚层干细胞的自我更新状态。一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)小鼠上胚层干细胞的获取；(2)小鼠上胚层干细胞在IWR1+Y27632条件下的传代和培养；a、取1.4-1.6ml、0.09-0.11％浓度的明胶加入34-36mmBDFalcon细胞培养皿，置于36-38℃、4.5-5.5％CO2浓度的细胞培养箱内，包被0.8-1.2h；b、取生长至70-80％密度的上胚层干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，以除去残留的培养液；c、加入0.8-1.2ml0.09-0.1％浓度的胶原酶Ⅳ消化细胞，4.5-5.5min左右，细胞边缘浮起，用移液器吹打，转移至14-16mlEppendorf离心管中，加入2.8-3.2mlDMEM培养液，继续吹打，使之混匀而终止消化；d、900-1100rpm离心2.8-3.2min后，吸去上清，加入2.8-3.2ml培养液重悬细胞；e、重复步骤d；f、900-1100rpm，离心2.8-3.2min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；g、取步骤a已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入1.8-2.2mlDMEM培养基，其中含有：9-11％FBS，0.9-1.1％MEM非必须氨基酸，1.9-2.1mML-Glutamin，0.09-0.1Mmβ-巯基乙醇，0.9-1.1mM丙酮酸钠，90-110单位的青霉素和90-110μg的链霉素；h、向培养基中加入1.9×104-2.1×104个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；i、依次添加3.9-4.1μMIWR1和0.9-1.1μMY27632，水平十字形晃动，使其混合均匀；j、将细胞培养皿置于36-38℃、4-6％CO2浓度的细胞培养箱内培养，即可。所述的一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于：小鼠上胚层干细胞的获取方法，包括以下步骤：1)具有繁殖能力的129品系小鼠雌、雄各一只合笼，每天早上7-9点钟检查雌鼠阴道部位阴道栓的形成情况，第一次看到时，记为交配完成第0.5天；2)确认交配完成后的第5.5天，以解剖方式获得母鼠子宫内的胚胎，用玻璃针从胚外组织中分离得到上胚层组织；3)取0.9-1.1ml、0.1％浓度的明胶加入ThermoNUNC4孔细胞培养板中，置于36-38℃、4.9-5.1％CO2浓度的细胞培养箱内，包被0.8-1.2h；4)弃明胶，向培养孔内加入0.48-0.52mlDMEM培养基，其中含有：9-11％FBS，0.8-1.2％MEM非必须氨基酸，1.9-2.1mML-Glutamin，0.09-0.11mMβ-巯基乙醇，0.8-1.2mM丙酮酸钠，90-110单位的青霉素和90-110μg的链霉素；同时添加终浓度为3.8-4.2μM的IWR1和终浓度为0.8-1.2μM的Y27632两种小分子化合物；5)将2)步中分离得到的小鼠上胚层组织置于4)步的条件下，36-38℃、4-6％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）小鼠上胚层干细胞的获取；（2）小鼠上胚层干细胞在IWR1+Y27632条件下的传代和培养；a、取1.4‑1.6 ml、 0.09‑0.11% 浓度的明胶加入34‑36 mm BD Falcon细胞培养皿，置于36‑38℃、4.5‑5.5% CO

【技术特征摘要】
1.一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）小鼠上胚层干细胞的获取；（2）小鼠上胚层干细胞在IWR1+Y27632条件下的传代和培养；a、取1.4-1.6ml、0.09-0.11%浓度的明胶加入34-36mmBDFalcon细胞培养皿，置于36-38℃、4.5-5.5%CO2浓度的细胞培养箱内，包被0.8-1.2h；b、取生长至70-80%密度的上胚层干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，以除去残留的培养液；c、加入0.8-1.2ml0.09-0.1%浓度的胶原酶Ⅳ消化细胞，4.5-5.5min左右，细胞边缘浮起，用移液器吹打，转移至14-16mlEppendorf离心管中，加入2.8-3.2mlDMEM培养液，继续吹打，使之混匀而终止消化；d、900-1100rpm离心2.8-3.2min后，吸去上清，加入2.8-3.2ml培养液重悬细胞；e、重复步骤d；f、900-1100rpm，离心2.8-3.2min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；g、取步骤a已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入1.8-2.2mlDMEM培养基，其中含有：9-11%FBS，0.9-1.1%MEM非必须氨基酸，1.9-2.1mML-Glutamin，0.09-0.1mMβ-巯基乙醇，0.9-1.1mM丙酮酸钠，90-110单位的青霉素和90-110µg的链霉素；h、向培养基中加入1.9×104-2.1×104个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；i、依次添加3.9-4.1µMIWR1和0.9-1.1µMY27632，水平十字形晃动，使其混合均匀；j、将细胞培养皿置于36-38℃、4-6%CO2浓度的细胞培养箱内培养，即可。2.根据权利要求1所述的一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于：小鼠上胚层干细胞的获取方法，包括以下步骤：1）具有繁殖能力的129品系小鼠雌、雄各一只合笼，每天早上7-9点钟检查雌鼠阴道部位阴道栓的形成情况，第一次看到时，记为交配完成第0.5天；2）确认交配完成后的第5.5天，以解剖方式获得母鼠子宫内的胚胎，用玻璃针从胚外组织中分离得到上胚层组织；3）取0.9-1.1ml、0.1%浓度的明胶加入ThermoNUNC4孔细胞培养板中，置于36-38℃、4.9-5.1%CO2浓度的细胞培养箱内，包被0.8-1.2h；4）弃明胶，向培养孔内加入0.48-0.52mlDMEM培养基，其中含有：9-11%FBS，0.8-1.2%MEM非必须氨基酸，1.9-2.1mML-Glutamin，0.09-0.11mMβ-巯基乙醇，0.8-1.2mM丙酮酸钠，90-110单位的青霉素和90-110µg的链霉素；同时添加终浓度为3.8-4.2µM的IWR1和终浓度为0.8-1.2µM的Y27632两种小分子化合物；5）将2）步中分离得到的小鼠上胚层组织置于4）步的条件下，36-38℃、4-6%CO2浓度培养一周后，胚胎组织向外生长，即可得到小鼠上胚层干细胞克隆集落。3.根据权利要求1所述的一种维持小鼠上胚层干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于：小鼠上胚层干细胞自我更新与细胞特性检测方法包括以下步骤：1）形态观察：使用LeicaDMIL倒置相差显微镜对IWR1+Y27632条件下、不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶守东，孙元元，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34