人羊膜上皮干细胞库的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种人羊膜上皮干细胞库的构建方法。其方法是取人羊膜，用胰蛋白酶消化后，过滤制成单细胞悬液；在DMEM／F12培养基中添加人表皮细胞生长因子、人转铁蛋白、人胰岛素、亚硒酸钠、丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸，使细胞在无血清条件下，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，换液和传代。将体外培养和扩增获得细胞置液氮冷冻保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建人羊膜上皮干细胞库。本发明专利技术储存人羊膜上皮干细胞，其具有来源广泛、不受伦理限制的特点，细胞培养和储存介质无动物源性。可提供上皮干细胞进行细胞治疗及其他应用。

Construction method of human amniotic epithelial stem cell bank

The invention relates to a method for constructing a human amniotic epithelial stem cell bank. The method is to take human amniotic membrane, digested with trypsin, filtered into single cell suspension; in DMEM / F12 medium supplemented with human epidermal growth factor, human transferrin, insulin, sodium selenite, alanyl glutamine two L peptide, alanine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, proline and serine, the cells in serum-free conditions, at 37 DEG C, saturated humidity, volume fraction in the incubator for 5% CO2 culture, and change the liquid passage. The cells were cultured and expanded in vitro, and the cells were stored in liquid nitrogen for the purpose of establishing a cell information file for retrieval, i.e., constructing a human amniotic epithelial stem cell bank. The invention stores human amniotic epithelial stem cells, and has the characteristics of wide source and no ethical restriction, and the cell culture and storage medium has no animal origin. Epithelial stem cells are available for cell therapy and other applications.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
的一种干细胞库的构建方法，具体涉及的是一种人羊膜上皮干细胞库的构建方法。
技术介绍
随着经济的发展，人民生活水平的提高，原先威胁人类健康的最大杀手——“传染病”在逐渐减少，而由于细胞、组织及器官损伤、病变及老化而引起的疾病逐渐增多。这些疾病仅仅靠传统的药物和医疗手段是不能解决的，而干细胞治疗将有望成为治疗这类疾病的主要手段。干细胞的自我更新和分化多能性的特点使之成为疾病发病机制研究，药物筛选以及细胞移植的理想对象和来源。干细胞治疗有望治疗细胞、组织及器官损伤、病变及老化而引起的疾病。细胞治疗实现产业化过程步骤包括细胞分离、培养、鉴定、建库、大量扩增、规模化生产等，构建人羊膜上皮干细胞库是实现转化医学研究，即临床细胞治疗的重要环节之一，建库是实现规模化生产先决条件。目前，细胞治疗需要提供细胞的来源主要为骨髓，但成人骨髓源干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者骨髓细胞的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制。人羊膜上皮干细胞(humanamnioticepithelialstemcells，简称hAESCs)是胎盘羊膜组织靠近胎儿侧的单层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人羊膜上皮干细胞库的构建方法，其特征是包括下述步骤：（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；（2）人羊膜收集及检测取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用磷酸盐缓冲液PBS或0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡20～40分钟；（3）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备取人羊膜先用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目不锈钢网过...

【技术特征摘要】
1.一种人羊膜上皮干细胞库的构建方法，其特征是包括下述步骤：（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；（2）人羊膜收集及检测取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用磷酸盐缓冲液PBS或0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡20～40分钟；（3）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备取人羊膜先用终浓度2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～10分钟，用PH7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟～2500转/分钟，时间为15分钟～30分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；（4）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增将第(1)步所得细胞以2.5×l07L-1～2.5×l010L-1密度接种于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每24小时～48小时全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用终浓度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每24小时～48小时全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程使人羊膜上皮干细胞逐渐得到扩增和纯化；所述无血清培养基采用DMEM／F12按体积1:1混合15.0～15.6g/L表皮细胞生长因子0.005～0.015mg/L人转铁蛋白1.0～7.0mg/L人胰岛素5.5～15mg/L亚硒酸钠5.0～7.2×103mg/LL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500mg/LL-丙氨酸10～25mg/LL-天冬酰胺4.9～10.9mg/LL-天冬氨酸9.3～17.3mg/LL-谷氨酸10.7～18.7mg/L甘氨酸5.5～8.5mg/LL-脯氨酸7.5～15.5mg/LL-丝氨酸6.5～11.5mg/L在上述第(4)步中，择优选择将第(3)步所得细胞以2.5×l07L-1-2.5×l010L-1密度接种于上述无血清培养基中培养；（5）人羊膜上皮干细胞库的构建取培养P2～3代人羊膜上皮干细胞保存于无血清培养液加10%二甲基亚砜DMSO中，细胞浓度调整至1×105个/ml～1×108个/ml,分装于冷冻管中，标记冻存日期，置液氮冷冻；液氮冷冻温度为-196℃；按其新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人羊膜上皮干细胞库；（6）人羊膜上皮干细胞复苏羊膜上皮干细胞复苏方法于60℃恒温水浴箱中，0.5～1min内快速复苏，按2.5×103/cm2～2.5×105/cm2接种于塑料培养瓶内，用含DMEM/F12无血清培养基中培养，按1:3传代，扩增后获得大量人羊膜上皮干细胞，备用。2.根据权利要求1所述的人羊膜上皮干细胞库的构建方法，其特征在于还包括细胞免疫荧光方法检测无血清培养人羊膜上皮细胞的表面标志物CK19、波形蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞希宁，施萍，赵峰，郎宏鑫，
申请(专利权)人：庞然，
类型：发明
国别省市：辽宁;21