本发明专利技术涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。在本发明专利技术中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞分离培养
，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮 细胞的分离培养方法。
技术介绍
脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，原来是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状伸 长部而形成的。脐带中动静脉是通过尿膜的血管形成，卵黄囊的血管即形成脐肠系膜动脉 及脐肠系膜静脉。当卵黄囊及其血管退化，脐动脉和脐静脉就发达起来，在这些间隙中可以 看到疏松的胶状的间充质。脐带是母体和胎儿的血液间进行〇) 2和O2、代谢废物和营养物 质交换的地方。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将〇 2和营养物质从胎盘运送 给胎儿，最后由子宫静脉将来自胎儿的代谢废物运走。 而某种激素和抗体等亦通过脐带从母体移交给胎儿，但运行机制尚未清楚。通过 体外培养分离和培养脐带上皮细胞，可对脐带上皮细胞的增殖特性，母婴之间的某些激素 和抗体的运转及机制等进行研宄。同时，分离出人脐带上皮细胞，也可应用于人体烧伤皮肤 的恢复应用，具有深远的医学研宄意义。 目前，并无人脐带上皮细胞分离的相关技术方案，参考其他组织的上皮细胞分离 方案，均采用组织块培养法来分离上皮细胞。 专利申请号为CN201210113304. X的专利技术报道了一种山羊乳腺上皮细胞的建系方 法，山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化为： (一）山羊乳腺上皮细胞的分离 (1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青 霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组 织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的 DPBS溶液洗涤一遍； (2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成Imm3小块，用移液器 吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持Icm 2左右； (3)37°C、5% CO2、饱和湿度下倒扣干涸培养6~12h，期间勿翻动； ⑷上述⑶倒扣干涸培养结束后，添加2mL乳腺上皮细胞培养液，于37°C、5% CO2、饱和湿度下正置培养； (5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4~6mL，自接种组织块 72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8~IOmL ;以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情 况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10% FBS+1% ITS+10ng/mLEGF ； (二）山羊乳腺上皮细胞的纯化 (6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80~90 %汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍； (7)加入乳腺上皮细胞消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细 胞消化液的成分包括0. 02% EDTA和0. 25% Trypsin ; (8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已 有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽； (9)迅速再次加入上述消化液于37°C、5% CO2、饱和湿度下消化； (10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终 止培养液终止消化；传代比例始终保持1 : 2 ;所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/ F12+10% FBS ； (11)重复（7)~（11)步骤，直至成纤维细胞去除干净。 专利申请号为CN201410176073. 6的专利技术提供了一种前列腺组织分离和建立原代 上皮细胞和/或间质细胞的方法，具体步骤包括： 第一步：将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到 离心管中，并离心； 第二步：用原代细胞培养液重悬组织并转移到T-25培养瓶中，在37°C培养箱中培 养1~2天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，2~3 天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出； 第三步：用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含 原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞：或者，在倒置显微 镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉或将上皮细胞和 组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转 移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。 然而，上述现有的组织上皮细胞的获取方法原代培养时间长，获得细胞总数低，细 胞纯度低掺杂成纤维细胞。因此，建立一种快速、细胞得率高、细胞纯度高的脐带上皮细胞 分离方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了。 该方法采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化，消化酶组合物性质温和，对细胞损伤 小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案： 本专利技术提供了一种消化酶组合物，包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶。 在本专利技术中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶联合消化， 该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇 在本专利技术提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。 在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。 在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10 在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为30 : 1 :5〇 在本专利技术提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg。 在本专利技术提供的一些实施例中，胶原酶VID的规格为125⑶U/mg。 在本专利技术提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg。 本专利技术还提供了该消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用；该消化酶组合 物包括透明质酸酶、胶原酶VDI和胰酶；作为优选，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 (5~30) :(1~10) :(1~10);在本专利技术提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与 胰酶的质量比为5 :1 :1 ;在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的 质量比为5 :5 :10 ;在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量 比为10 :10 :1 ;在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VDI与胰酶的质量比为 30 ：1 ：5〇 本专利技术还提供了一种脐带上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤： 采用消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获得脐带上皮细胞进行细胞培 养；该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶W和胰酶。 作为优选，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为（5~30) :(1~10) :(1~ 10) 〇 在本专利技术提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :1 :1。 在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为5 :5 : 10。 在本专利技术提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶VID与胰酶的质量比为10 : 10 :1〇 在本专利技术提供的另一些本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种消化酶组合物，其特征在于，包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，吴子杰，王小燕，李平，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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