人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法技术

本发明专利技术公开了人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法，其包括以下步骤：（1）采集脐带血:无菌条件下,针吸法抽取足月顺产或剖腹产手术的新生儿脐带血放入离心管内，用肝素抗凝，冷冻保存；（2）脐带间充质干细胞的体外培养、扩增；（3）生物活性因子的制备；（4）裂解液的制备。本发明专利技术的生物活性因子或物质中不含任何动物源成分，利用此生物活性因子或物质可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。

【技术实现步骤摘要】
201610376245

【技术保护点】
人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法，其特征在于：其包括以下步骤：（1）采集脐带血:无菌条件下,针吸法抽取足月顺产或剖腹产手术的新生儿脐带血放入离心管内，用肝素抗凝，冷冻保存 ；（2）脐带间充质干细胞的体外培养、扩增：①分离单个核细胞：在抽取新生儿脐带血后12 h内 ,用 Fi‑coll‑ Hypaque分离液分离单个核细胞 ( MNC), 并用MDM培养液洗涤 3次；②将上述分离后的单个核细胞滴入1 g／L的I型胶原酶置于37℃振荡器中消化1 h，消化后以1 000rr／mjn(离心半径16 cm)离心15min，吸出上层悬浮组分，100目筛网进行滤过，滤过后的液体以1 000 r／mjn(离心半径16 cm)离心5 mjn，弃上清液；③将上述步骤②得到的消化液接种于 MDM 完全培养基（含 20%的胎牛血清 (FBS)、50 μ mol /L 2‑ 巯基乙醇 、10％胎牛血清、50 μg·/mL抗坏血酸、0．5 mmol/L甘油磷酸）中，调整细胞密度为 4.82 ×105/m l, 然后于37 ℃、 饱和湿度条件下在5% 二氧化碳培养箱中培养；④每3‑5天半量换液1次， 培养12天细胞生长约80％汇合， 并收集更换的废培养液于 ‑80℃冰箱中保存 ；⑤当细胞约 80％汇合时，加入1 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化15 min， 以 2×10 5 cells/ml 接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于 ‑80℃冰箱中保存 ；⑥当细胞约 80％汇合时， 缓慢加入培养液，放入5％二氧化碳培养箱中37 ℃条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min， 以相差显微镜观察细胞游出的情况，待细胞密度达到80%后按1∶2的比例传代，收集第 1 代细胞；⑦ 再加入培养液，在二氧化碳培养箱中继续培养，每3‑5天半量换液1次，并收集更换的废培养液于 ‑80℃冰箱中保存 ；⑧重复步骤⑤ 即可；⑨分离、 纯化获得高纯度间充质干细胞， 利用 FACS Calibur 流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度；（3）生物活性因子的制备：将步骤（2）脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、 低温分离、 超滤和浓缩，超滤和浓缩的处理方法为：利用3K的超滤膜过滤， 体积浓缩 1/10，保留生物活性物质， 再经截留分子量为 50KD 中空纤维超滤柱超滤， 将超滤后的液体进行浓缩， 即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；（4）裂解液的制备：将体外培养获得的脐带造血干细胞浓度调整为 5×10 6 ‑ 1×10 7 个 / 毫升密封于冻存管中 经超低温液氮反复冻融 5 ‑7次至细胞破碎，再通过低温分离、 纯化等现代生物技术手段， 便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张正亮，刘大海，
申请(专利权)人：安徽惠恩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34