一种肝脏体外培养的方法技术

本专利涉及一种肝脏体外培养的方法，该方法包括肝脏原位灌注、肝脏离体和肝脏体外培养。肝脏原位灌注包括利用低温条件、自制培养液和重力灌注方式对肝脏进行原位灌注。肝脏离体时在继续灌注的前提下通过常规肝脏分离手术获取离体肝脏。肝脏体外培养模拟肝脏体内生理环境，包括循环方式、肝脏灌注压、肝脏灌注量、供氧方式、稳定酸碱度、温度恒定、力学条件，利用自制肝脏体外培养系统培养离体肝脏。本发明专利技术通过模拟肝脏生理条件，为幼体肝脏培养成成体肝脏研究提供了一种方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，主要用于哺乳动物肝脏体外培养，特别是大鼠和小香猪肝脏体外培养。
技术介绍
目前国内外终末期肝病治疗唯一有效手段是肝移植，而在中国乃至世界范围内，肝移植供体来源极度紧缺。而目前无论肝脏保存技术如何发展，都无法根本性解决肝移植供体供需比极度失衡的问题。因此肝脏器官培养成为开辟肝移植供体来源的新途径。目前在已有技术中，肝脏器官培养还存在于细胞团组织培养层面上，如美国专利US20080193421 A1和中国专利CN102391983B，名义上是三维培养，但其实质仍然是的氧气和营养的渗透性供给，不能给予肝脏合适的存活和生长条件。美国专利US5976870 A，还停留在组织切片培养层面上，不能形成具有正常结构和功能的肝脏。另一方面，人工肝技术虽然发展快速，但是肝脏细胞脱离正常生理环境下的状态与功能很难长时间维持，人工肝技术存在实践上的诸多困难。再者如美国专利US8802361 B2，目前肝脏体外循环灌注培养类技术如肝脏机械灌注与保存中，通常利用低温和机械灌注，其中低温会导致肝脏低温损伤和肝脏ATP消耗，机械灌注中蠕动泵或离心泵提供动力的灌输方式会导致肝脏微结构和微循环的损伤，诸多因素导致肝脏无法长期在机械灌注模式中存活。迄今为止完全模拟肝脏生理状态的培养方法仍然没有实现。肝脏体外培养技术还处于理论验证阶段，其中涉及多学科多领域的交叉融合应用，肝脏从体外保存到实现体外生长，需要在参考模拟肝脏在体内的生理环境基础上创造有利于肝脏恢复与生长的温和环境。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是如何模拟肝脏体内生理环境从而实现肝脏体外培养。本专利技术针对现有技术问题所提出的技术方案为：提供一种哺乳动物肝脏体外培养的方法。本专利技术方法包括以下步骤：a、原位灌注，手术暴露肝脏后，对肝脏利用低温培养液进行原位灌注，减轻缺氧缺血损伤以及避免凝血栓塞。b、肝脏离体，通过常规肝脏分离手术获取离体肝脏；c、体外培养，将离体肝脏接入体外培养系统，通过各种培养条件的模拟，实现肝脏体外培养。其中上述方法所述肝脏为成年SD大鼠和2月龄香猪的健康肝脏；其中上述方法所述培养液为以经过应用验证的细胞培养基RPMI1640培养基为基础，加入血清10%-90%，脂肪乳1%-5%，抗生素终浓度为青霉素100U/mL，链霉素100U/mL、山梨酸钾5mL/L，右旋糖酐40为0.1%等，具有能够为肝脏提供营养、生理渗透压、防止感染等作用。RPMI1640培养基成分如下：其中上述方法中步骤c所述各种条件模拟包括以下条件： a）循环方式：模拟肝脏肝动脉和肝门静脉入肝-肝静脉出肝的血液循环方式，通过高度差提供压力输入，从肝动脉和肝门静脉输入培养液，培养液从肝静脉流出，并利用蠕动泵将流出培养液抽回高处储液器完成循环。b）肝脏灌注压：利用低于生理血压的条件，肝动脉入肝灌注压约为肝动脉入肝血压的30%，即500mmH2O，而门脉入肝灌注压约为50 mmH2O，约为正常门脉压（110-180 mmH2O）的30%-50%。c）肝脏灌注流量：正常入肝血流中，肝动脉占比25%，门脉占75%。为减少门脉灌注对肝窦的伤害，经过测试，确定流量分配比例如下：动脉流量为0.5mL/min▪g肝脏，占总入肝流量50%，门脉流量为0.5mL/min▪g肝脏，占总入肝流量50%。d）供氧方式：利用鼓泡式超饱和氧合为肝脏供氧，气泡直径小于50μm，并利用95%O2-5%CO2和100%O2联合并设置不同比例供氧，且能调节CO2供应量。e）稳定酸碱度：利用CO2供应量变化以及酸碱调节试剂如NaHCO3的添加，稳定培养液pH为7.35-7.45，模拟血液生理pH条件。f）温度恒定：利用精密控温水浴为肝脏提供恒温38.5℃条件。g）物理条件：通过悬吊+液体悬浮模式为肝脏提供模拟体内力学环境的条件。详见图1，即将利用与肝脏相连的膈肌以及血管进行水平和垂直方向的三维悬吊固定，并利用肝脏浸没在培养液中产生的浮力，使得肝脏处于受力平衡和舒展状态，保证肝脏微结构的正常和微循环的通畅。其中，上述方法所述肝脏体外培养系统为自行研制肝脏体外培养系统，详见图2，包括以下组件：a）、动力组件：最大流量为500mL/min的蠕动泵；b）、氧合组件：包括氧气瓶，氧气减压阀，氧气洗瓶，氧气流量计，氧气除菌过滤器，氧气分散器；c）、储液组件：包括氧合储液器，HA储液器，肝室，PV储液器，回流储液器，透气装置；d）、温控组件：双孔和四孔恒温水浴槽；e）、监控组件：在线溶解氧检测仪和在线pH检测仪；本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用高度差提供灌注压，即利用高度差产生的压力使得培养液进入肝脏，灌注压的标定直接根据高度差单位mmH2O来确定与表示。随时根据肝脏状态变化调整高度差以调节灌注压。不仅能够为肝脏提供足够的液体进出量以实现氧气和营养的供给，而且降低了对于肝脏微结构和微循环的剪切力伤害，是实现肝脏长期体外培养的必要条件。本专利技术实现了无载体供氧，利用大剂量的氧气与培养液鼓泡超饱和氧合，使得氧气在培养液中超饱和，并在氧气逸出前将随着培养液带入肝脏，从而使得肝脏获得足够的氧气供给，实现无载体下的足量氧气供给。无载体供氧避免了血液以及血液制品使用带来的感染危险，以及溶血、凝血等不利情况，同时还避免了免疫排斥反应对于肝脏造成的损伤。目前同行业并无同类型技术，类似技术均为肝脏体外循环灌注。本技术能够实现体外培养肝脏，模拟肝脏生理环境，使得肝脏各项指标接近生理标准，并且BrdU细胞增殖实验表明，在本技术中，肝脏细胞实现了体外培养条件下的增殖。该证据充分表明本技术已经在一定程度上实现了肝脏体外培养。本专利技术将直接作用于肝移植供体来源，利用人类幼体肝脏，利用本专利技术技术进行体外培养，达到临床肝脏移植标准，供给临床肝脏移植需要。本专利技术的的推广将实现肝移植供体来源的多元化，改变目前肝移植供体短缺的现状，并且对于其他器官培养的实现具有参考价值和指导意义。附图说明图1、悬吊式肝脏固定方式。图2、本专利技术的肝脏体外培养系统示意图。图3、大鼠肝脏体外培养BrdU细胞增殖检测结果。具体实施方式以下通过具体实施方式，对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供了一种哺乳动物肝脏体外培养的方法，包括以下步骤：1、术前准备：a、动物麻醉，备皮，固定，并为动物提供保温垫，麻醉方式为静脉注射，所用麻醉剂为戊巴比妥钠，用量为30mg/kg；b、器械摆放：用干净洞巾将猪及手术台铺好，将手术刀，手术剪，镊子等器械按照手术器械摆放原则摆放。2、原位灌注：a、碘酒消毒：将碘酒棉球将猪右腿擦拭一遍，换另一干净棉球，将腹部中间向四周画圈擦拭3次；b、全身肝素化：用辅料镊挑起左腿皮肤(碘酒消毒)，用剪刀剪开皮肤，暴露血管，注入肝素至150U/kg；c、打开腹腔：器械开腹，用止血钳将腹壁与洞巾夹住，拉至两边，用拉钩将术野暴露开，搬移肠和脂肪；d、动脉插管：将腹主动脉与下腔静脉剥离脊柱，埋入捆绑带与线，将下腔静脉与腹主动脉剥离，将静脉结扎，将动脉上下端断流，其间剪口，插管，用预埋捆绑带捆好，再用预埋缝合线结扎固定；e、输尿管、膀胱、胆管的处理：用止血钳夹紧胆囊，剥离肝脏与胆囊，在此操作之前将进入胆囊的血管结扎，胆囊剥离下来之后结扎（SD大鼠操作时无需分离胆囊）。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法涉及（但不限于）体外培养已经离体的肝脏器官。

【技术特征摘要】
1.一种方法涉及（但不限于）体外培养已经离体的肝脏器官。2.其特征在于模拟肝脏生理环境，提供肝脏生长所需要的各种条件，促进离体肝脏存活和生长。3.该方法包括：该方法包括肝脏原位灌注、肝脏离体和肝脏体外培养。4.肝脏原位灌注包括利用低温条件、自制培养液和高度差灌注方式对肝脏进行原位灌注。5.肝脏离体时在继续灌注的前提下通过常规肝脏分离手术获取离体肝脏。6.肝脏体外培养模拟肝脏体内生理环境，包括循环方式、肝脏灌注压、肝脏灌注量、供氧方式、稳定酸碱度、温度恒定、力学条件，并利用自制肝脏体外培养系统培养离体肝脏。7.如权利要求4所述，肝脏原位灌注是利用4℃低温条件，降低肝脏细胞代谢速率，减小肝脏原位灌注过程中的热缺血损伤。8.如权利要求4所述，自制培养液为在细胞培养基RPMI1640培养基基础上，加入血清，脂肪乳，青霉素，链霉素。9.如权利要求6所述，循环方式为模拟肝脏两进一出的血液循环方式，通过高度差提供压力输入，从肝动脉和肝门静脉灌注培养液，培养液从肝静脉流出并，并利用蠕动泵将流出培养液抽回高处储液器。10.如权利要求6所述，肝脏灌注压为肝动脉入肝压约为肝脏正常生理压力的20%-50%，即350-800mmH2O，而门脉入肝压约为50-100 mmH2O,约为正常门脉压（110-180 mmH2O）的50%-80%。11.如权利要求6所述，肝脏灌注量为：动脉流量为0.5mL/min▪g肝脏，占总入肝流量50%，门脉流量为0.5mL/min▪g肝脏，占总入肝流量50%。12.如权利要求6所述，供氧方式为鼓泡式超饱和氧合方式...

【专利技术属性】
技术研发人员：许健健，许莉莉，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：合肥华琪生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34