本发明专利技术公开了一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法；通过在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平，来提高MSC的增殖能力，保护MSC的分化能力，延缓MSC的衰老。具体是以慢病毒为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。与现有技术相比，本发明专利技术能有效提升年轻人源MSC的体外扩增能力；能逆转老龄70‑80岁以上人源MSC的衰老症状；能促进MSC的成骨分化潜能；能抑制MSC的成脂分化潜能。
Method for delaying senescence of human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro
The invention discloses a delay of human bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro in ageing method; by increasing the expression level of FOXP1 in human MSC cells, increased the proliferation of MSC, MSC protection ability of differentiation, delaying senescence of MSC. In particular, the lentiviral vector was used to transfect human MSC, and the positive clones were screened by MSC. Compared with the prior art, the invention can effectively improve the amplification ability of young people MSC in vitro can reverse aging; 70 over the age of 80 MSC of human aging symptoms; can promote MSC differentiation into bone; can inhibit MSC differentiation into fat.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种延缓人源骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养导致衰老的方法。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是一种重要的成体干细胞(Caplan，1991)。MSC在身体器官的多个部位，如脐带血都能检测到(Goodwinetal.，2001)，其中骨髓是MSC重要的储藏部位(FehrerandLepperdinger，2005；Mendez-Ferretetal.，2010)。骨髓间充质干细胞具有高度的自我更新能力，同时具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力(Biancoetal.，2008a；Biancoetal.，2008b；Nombela-Arrietaetal.，2011；Pittengeretal.，1999)，参与了骨骼系统的形成和稳态保持。大部分研究将成骨、成脂肪和成软骨的三系分化能力作为定义间充质干细胞的“金标准”(Biancoetal.，2008b)。MSC细胞表面标记包括CD73，CD90和CD105，但不表达CD11b，CD14，CD34，CD45，和HLA-DR。MSC可以用来移植治疗各种疾病(AnkrumandKarp，2010；Newmanetal.，2009；Uccellietal.，2008)，包括关节损伤(Barry，2003)；心肌缺血(Amadoetal.，2005)，成骨发育不全症(Horwitzetal.，2002)，移植免疫排斥(Newmanetal.，2009)等。但由于骨髓MSC数量比较少，因此临床应用需要分离MSC进行体外大量扩增和培养。MSC能体外培养传代30代以上(Friedensteinetal.，1987)。MSC体外传代培养过程中，前6-8代细胞相对正常(Khooetal.，2008)，但长时间传代培养容易导致形态和分化能力发生改变，如MSC传代10-15代后，它仍能保留成骨分化的潜能，但成脂分化能力却丧失了(Digirolamoetal.，1999)。人源MSC的传代培养还会导致增殖潜力的不断下降，端粒长度缩短等衰老症状(Baxteretal.，2004；Digirolamoetal.，1999；MetsandVerdonk，1981)。这些体外培养导致的MSC衰老和增殖潜力下降，限制了MSC的移植和临床治疗应用。另外，老龄人群的MSC，相对于年轻人的骨髓MSC，增殖潜能和分化能力都大幅下降(Stenderupetal.，2003)，这也限制了老龄人群MSC的移植和治疗运用。通过细胞生物学或遗传学方法，改变MSC细胞当中衰老相关基因的表达水平，可以通过病毒载体，哺乳动物细胞表达质粒等方法转染细胞，在细胞中上调基因表达(Gronthosetal.，2003；Shietal.，2002；Simonsenetal.，2002)。通过同源重组的遗传方法，在人类基因组AAVS1，Rosa26，CCR5位点插入目标基因cDNA(Sadelain，etal.，2012)。近年，也有通过Cas9/sgRNA介导的方式上调或下调基因的表达水平(Gilbert，etal.，2013)。现有提高和改善MSC体外培养导致的衰老的方法有如下几种方法：1.卡路里限制：高糖培养基容易导致MSC培养过程提早分化和衰老，如0.5g/L或者0.25g/LGlucose浓度的培养基，相对于4.5g/LGlucose的高糖培养基，可以提高MSC的存活率，CFU-F克隆形成数量可以提高10-15％(Blazeretal.，2002；Stolzingetal.，2006)。2.运用血小板裂解物替代小牛血清：传统人源MSC的培养可以用基本培养基DMEM或αMEM，添加小牛血清FBS。但是这些培养基和添加物，容易成为疯牛病传染的介质，而且不同批次FBS的质量不同，给MSC的传代和繁殖造成不稳定的影响。因此，用于临床治疗的MSC，多采用血小板裂解物替代小牛血清(Capellietal.，2007；Capellietal.，2015；Riordanetal.，2015)，这样也能提高MSC增殖速度，节省培养的时间和成本。3.低氧培养：研究表明，1％O2或5％O2的低氧环境，相比21％O2的正常环境，可以有效延缓MSC培养传代过程中的衰老(Jinetal.，2010；Tsaietal.，2011)，减少DNA损伤(Bigotetal.，2015)。在培养基当中添加维生素C和氧化抑制剂NAC，可以提高MSC的增殖潜能(Fehreretal.，2007；Kashinoetal.，2003)。Isothiocyanates，另一种氧化抑制剂，也可以降低MSC的DNA损伤，保护MSC的干细胞属性，延缓MSC的细胞衰老(Zanichellietal.，2012)。在培养箱中补充3％氢气也可以延缓MSC衰老，保护MSC干细胞属性(Kawasakietal.，2010)。4.Serum-freemedia/xeno-freeFDA-approvedculturemedium(SFM/XF)，一种无血清无动物添加物的培养基，据称可以有效促进MSC的体外扩增，保持MSC干细胞属性(Oikonomopoulosetal.，2015)。5.在MSC当中过表达端粒酶hTERT：在人源MSC当中，通过逆转录病毒过表达端粒酶催化亚基hTERT，可以有效延长MSC的寿命和成骨分化潜能(Gronthosetal.，2003；Shietal.，2002；Simonsenetal.，2002)。6.敲低Rb2基因：在MSC当中敲低Rb2基因，会减少传代培养过程中的DNA损伤，提升MSC的增殖潜能(Alessioetal.，2013)。7.HDAC抑制剂处理：敲除HDAC基因，或运用HDAC抑制剂处理可以适当延缓MSC体外培养过程中的衰老(Jungetal.，2010)。8.抑制溶血磷脂酸受体：溶血磷脂酸lysophosphatidicacid是合成细胞膜磷脂的重要成分，敲除溶血磷脂酸信号通路，或者药物抑制溶血磷脂酸受体，都可以促进MSC的增殖，延缓MSC的衰老(Kanehiraetal.，2012)。9.雷帕霉素处理：雷帕霉素是PI3/AKT/mTOR信号通路的重要配体，雷帕霉素处理MSC细胞，可以保持MSC的增殖潜力和成骨分化潜能，降低DNA损伤积累，改善免疫调节机制，延缓MSC的衰老(Gharibietal.，2014；Guetal.，2016)。10.添加Fgf2，PDGF-BB，EGF，维生素C：在MSC培养基中添加Fgf2，PDGF-BB，EGF，维生素C等，可以大大刺激MSC的增殖速度和扩大传代数量(Coutuetal.，2011；GharibiandHughes，2012)。在培养基当中添加Fgf4蛋白，可以适当刺激MSC的体外扩增和增殖，但不会影响MSC的成骨或成脂分化能力(Farreetal.，2007)。然而，上述方法存在如下问题：1、运用血小板裂解物替代小牛血清，会影响MSC的免疫抑制能力，会导致MSC传代和增殖过程中的自发分化(Oikonomopoulosetal.，2015)。2、低氧培养，1％O2的培养条件，普通实验室为21％O2浓度，不本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法，其特征在于，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平。
【技术特征摘要】
1.一种延缓人源骨髓间充质干细胞体外培养导致衰老的方法，其特征在于，在人源MSC细胞中提高FOXP1表达水平。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以病毒为载体，转染人源MSC，抗生素筛选阳性MSC克隆并传代扩大培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒为LV、AAV或pMSCV病毒载体。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1、分离和培养人源骨髓MSC，按1∶3～1∶6比例稀释传代培养；S2、在人源骨髓MSC传代培养液中加入含FOXP1基因的慢病毒原液，感染；S3、吸去含病毒的培养基，换成含青霉素、链霉素的MSC培养基，培养，使病毒携带的抗性基因表达；S4、加入含Puromycin的MSC培养基进行筛选培养；S5、将感染并在筛选过程中存活的细胞继续消化传代，待扩增至获得稳转细胞株即可。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，在人源骨髓MSC传代培养液中按MOI为5～20...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭熙志，李汉骏，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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