回输临床治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法技术

本发明专利技术涉及一种回输临床治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法。组织构建和细胞体外培养是再生医学干细胞治疗领域的至关重要的热门科技领域。回输临床治疗用细胞是一种前瞻性的医疗手段，本发明专利技术特征是采用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法，获取高纯度的临床治疗用hCDMSC，采用细胞外基质(extracellular matrix,ECM)理论指导设计开发一种从未公开的报道的，叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质，筛选贴附培养技术。该无血清培养体系保持原始未分化干性细胞，获取符合细胞协会(ISCT)标准的干细胞其活性与传代能力极强，多组合培养液梯度驯化培养理论，使得hCDMSC具备回输治疗应用的安全性稳定性保障，是临床药物设计开发医疗机构开展干细胞治疗的科技基础，同时也是组织工程领域具备前景的种子干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物干细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环境分离筛选，hCDMSC的无血清培养、扩增、储存技术。组织构建和细胞体外培养是再生医学干细胞治疗领域的至关重要的热门科技领域。回输临床治疗用细胞是一种前瞻性的医疗手段，本专利技术特征是采用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法，获取高纯度的临床治疗用hCDMSC，采用细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)理论指导设计开发一种从未公开的报道的，叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质，筛选贴附培养技术。该培养体系保持原始未分化干性细胞，获取符合细胞协会(ISCT)标准的干细胞其活性与传代能力极强，无血清多组合培养液梯度驯化培养理论，使得hCDMSC具备回输治疗应用的安全性稳定性保障，是临床药物设计开发医疗机构开展干细胞治疗科技基础，同时也是组织工程领域具备前景的种子干细胞。
技术介绍
近年来，国际国内对干细胞再生医学研究领域越来越重视，细胞治疗再生医学得到了前所未有推进，科研领域沐浴在时代的朝阳下得以蓬勃发展。尤其是间充质干细胞已经成为一种新的治疗手段，广泛应用修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、临床骨修复、软骨修复、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腱修复、基因治疗、血管支持、角膜损伤、烧伤烫伤创面修复等多种疾病。经过体外培养扩增后的干细胞在组织工程再生和多种组织修复中展示出令科研工作者印象深刻的治疗广泛性潜能，这种潜能是科研领域毋庸置疑的发展方向。间充质干细胞(MesenchymalStemCellsMSCs)是一类自我更新和多向分化的能力。来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞。是一种非血源性的多功能干细胞，广泛存在于人体不同组织中，如骨髓、脂肪、牙周膜及脐带，胎盘组织等。近几年来有学者发现其主要来源骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSc)可以自体移植，避免了移植后的免疫排斥。骨髓间充质干细胞的体外扩增比较容易，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能，所以在临床已经应用于中枢神经系统、心血管及免疫系统等多系统疾病的治疗，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及。BMSc可体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞、并在一定的条件下诱导可分化为神经细胞，而且可进行自体移植,避免免疫排斥，被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。也有研究者发现在胎盘组织中也含有丰富的间充质干细胞，提示可以将其提取作为干细胞移植治疗的备选细胞。胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞。骨髓间充质干细胞，在美国FDA已批准在心肌干细胞移植方面进入一期临床试验,国内也开展多个二期临床试验，这充分展示了MSCs的巨大应用前景。不过骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量较少，而且随着年龄的增加，在骨髓中的含量逐渐减少，其增殖分化能力也逐渐减弱；同时骨髓间充质干细胞的取材是有创侵入性操作，增加了捐献者的痛苦和感染的机会，所以骨髓间充质干细胞的临床应用受到了一定的限制；并且病患严重感染、骨髓恶性肿瘤随着年龄的增长骨髓细胞数及增殖、分化能力均明显下降等情况下,患者就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSCs,为此很有必要寻找新的MSCs来源。足月胎盘是分娩的废弃物，取材容易，对供者不造成损伤，无伦理问题，而且胎盘体积大，获得干细胞相对较多，所以胎盘间充质干细胞更方便适用于临床。有学者在叶状绒毛膜组织成功分离培养出胎盘间充质干细胞，并观察其生物学特性和抗凋亡细胞因子血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子的分泌水平，结果证实叶状绒毛膜间充质干细胞的生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，并能分泌血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子和肝细胞生长因子。已有研究证实胎盘间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞类似的功能和特性，两者的多向分化潜能也类似。胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由间质、血管、滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，也含大量的干细胞。叶状绒毛膜含有MSCs,在胎儿出生后多作为废物与一起被丢弃的叶状绒毛膜也含有与骨髓间充质干细胞相似特性的细胞，叶状绒毛膜组织中确含有这些前体细胞，可以极大程度上地解决了干细胞的来源问题。胎盘来源的间充质干细胞的增殖能力更强。国内外很多研究者发现，胎盘来源间充质干细胞在体外实验中可被诱导分化为中胚层的心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、内胚层的胰岛细胞、肝细胞以及外胚层的神经元、星形胶质细胞，软骨细胞；而且这些结果同样在心肌梗死、帕金森大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓损伤灵长类动物模型等体内模型中治疗显效得到了证实。也有报道称，胎盘来源间充质干细胞将来可进一步应用于修复人膝关节退行性改变或膝关节半月板损伤科研实验。间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞，经过多年多学者的研究后，虽然组织工程已经获得了很大进展。然而，但由于目前缺乏理想筛选方法，间充质干细胞不易获取、体外扩增困难等限制，使其在临床级别回输的应用受到限制。因此，寻找一种易于获得、免疫原性低、易于体外扩增的临床治疗级别的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决的问题之一。本专利技术尝试直接从胎盘叶状绒毛膜组织中分离间充质干细胞的专利技术专利，并对所得细胞的生物学特性进行鉴定，为研究间充质干细胞分化能力，将其作为种子细胞开展临床应用研究提供独特的思路获取体系依据，进行了间充质干细胞临床治疗以及基础研究奠定科研基础。再生组织工程细胞建立工作始于本世纪(Harrison1907,Carrel1912),指导引领着生物学，临床医学材料等各大衔接领域，被称为重要的基础科学之一。组织构建和细胞体外培养是至关重要的课题。从供体捐献者活体取组织，模拟体内生理环境等系列特定体外微环境体系，进行孵化培养，使得组织细胞健康生长。由于间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，使得体外筛选培养的人来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功能，避免潜在有害基因对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等的影响，在基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向等均有历史时期的重要不可取代的指导意义。细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分，是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的极其重要场所。早期研究学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种临床治疗级细胞治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞制备方法，由以下步骤组成；(1)人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合；(2)筛选用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质制备；(3)应用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质与人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合筛选培养人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞，以及人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞长期冻融保存液制备。

【技术特征摘要】
1.一种临床治疗级细胞治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞制备方法，
由以下步骤组成；(1)人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合；
(2)筛选用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质制备；(3)应用叶状绒毛膜高拟
体内细胞外基质与人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合筛选培
养人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞，以及人胎盘叶状绒毛膜来源的间
充质干细胞长期冻融保存液制备。
2.一种利用权利要求1所述的人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组
合包括：
配制培养液A：胎盘多肽注射液0.05ml/L、EGF5～25ng/ml、干细胞生长
因子(SCF)2～11ng/ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1mg/L、维
生素C1～4μg/ml、胰岛素5～8μg/ml、青霉素50～100u/ml、链霉素100u/mL、
氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基-低糖DMEM/F12(3:1)定容到500ml。PH
控制在7.2～7.4；
配制培养液B：胎盘多肽注射液0.1ml/L、人血清白蛋白(HSA)1～3g/L、
人血纤粘蛋白(FN)1～5μg/L、人层粘连蛋白(LN)5～10μg/L、血小板衍
生因子(PDGF)1～10mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)1～6mg/L、血管内皮细胞生
长因子(VEGF)1～6μg/L、EGF5～10ng/ml、维生素B1～5mg/L、叶酸1～
10ng/ml、维生素E0.05～1mg/L、维生素B40.5～1mg/L、黄体酮0.01～
0.04μg/L、辅酶Q100.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、
肝素钠0.1～0.3g/L、腺苷10～15ng/ml、胰岛素5～6μg/ml、青霉素100u/ml、
链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。
PH控制在7.2～7.4；
配制培养液C:人胎盘组织液0.01～0.3ml/L、人血清白蛋白(HSA)0.1～
6g/L、人血纤粘蛋白(FN)3～25μg/L、人层粘连蛋白(LN)10～60μg/L、
重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)1～4mg/L、血小板衍生因子(PDGF)10～
20mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)6～10mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)6～
10μg/L、重组人肝细胞生长因子(HGF)5～20mg/L、EGF、bFGF10～25mg/L、
重组人脑源性神经营养因子(BDNF)15～40ng/ml、维生素B1～4mg/L、叶酸1～
15ng/ml、黄体酮0.01～0.06μg/L、维生素E0.05～1.2mg/L、维生素C0.1～

\t10mg/L、维生素B40.1～0.5mg/L、辅酶Q100.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、
牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、还原性谷胱甘肽3～6μg/L、油
酸0.5～7.5mg/L、转铁蛋白6～20mg/L、腺苷10～25ng/ml、胰岛素5～
7mg/L、多聚赖氨酸4～6mg/L、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养
基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。
3.一种利用权利要求1所述筛用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质制备方法，包
括其中所述的叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质；制备包括以下步骤：A)叶状
绒毛膜组织消毒处理；B)叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质脱细胞处理；C)
将消毒或经脱细胞处理的叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质进一步进行低温...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凌仪，曹小丽，陈玲，陈拓，陈强，李小珍，张颖，沈境，李磊，周燕婷，
申请(专利权)人：王凌仪，
类型：发明
国别省市：吉林;22