本发明专利技术涉及一种培养Marc‑145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺。本发明专利技术提供的培养Marc‑145细胞用的无血清培养基能促进Marc‑145细胞快速生长和增殖，且本发明专利技术培养Marc‑145细胞用的培养基不含血清，动物源成分含量低，有效降低了后续病毒纯化的分离难度，同时也提高了疫苗的安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无血清培养基及其制备方法，具体涉及一种培养Marc-145细胞用 的无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
猴胚胎肾上皮细胞(Marc-145)是上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA104 细胞)克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞主要用于病毒的培养，特别是猪繁殖与 呼吸障碍综合病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感。 猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起，以成 年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征的传染病，是一种免疫抑制病， 常常继发其他病原感染。目前，该病在全世界几乎所有养猪地区都已流行，给世界养猪业造 成了巨大的经济损伤。我国高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征的预防采用弱毒疫苗或者灭 活疫苗进行预防。PRRSV的增殖对细胞有严格的选择性，其中Marc-145细胞对PRRSV敏感性 强，病毒可以达到很高的滴度，因而广泛应用于高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的 灭活疫苗或者活疫苗生产。 现有的Marc-145细胞培养过程中，通常需要加入8-10%的牛血清进行培养。如公 开号为CN102002482A的专利技术专利申请文件，公开了一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生 产方法，其中公开了细胞生长液的配方:体积百分含量为90-92 %的DMEM溶液、8-10 %的牛 血清、1 %的双抗、1 %的谷氨酰胺;公开号为CN101748101A的专利技术专利申请文件，公开了一 种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法，其中公开了生长液为添加10%新生牛血清的DMEM 培养液。 血清能为细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但 其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确， 不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培 养基是在基础培养基的基础上，加入血清替代成分，制备得到的培养基既能满足细胞的培 养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。研发一种培养Marc-145细胞用的 无血清培养基，可有效降低后续病毒纯化的分离难度，同时也可有效提高疫苗的安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能促进Marc-145细胞快速生长和增殖，不含血清，动 物源成分含量低的培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法。 为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下： 一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分:胰岛素 样生长因子0.1~lOyg/mL、表皮生长因子5~20yg/mL、成纤维生长因子0.1~10yg/mL、转铁蛋 白5~20yg/mL、亚硒酸钠20~30yg/mL、小麦蛋白酶解物1~5mg/mL、1~5%体积百分比的酶解明 胶溶液和乙醇胺1 〇~20yg/mL。优选地，本专利技术提供的培养Marc-145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还 包括如下组分:胰岛素样生长因子5yg/mL、表皮生长因子10yg/mL、成纤维生长因子8yg/mL、 转铁蛋白15yg/mL、亚硒酸钠25yg/mL、小麦蛋白酶解物4mg/mL、2%体积百分比的酶解明胶溶 液和乙醇胺15yg/mL。 本专利技术所述的基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基和F12培养基中的一种或两 种。优选地，所述的基础培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其体积比为1:1。 优选地，本专利技术所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配 制而成。 相应地，本专利技术还提供所述的培养Marc-145细胞用的无血清培养基的制备方法， 包括如下步骤： S1:制备小麦蛋白酶解物； S2:制备酶解明胶溶液； S3:向基础培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长 因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦酶解植物蛋白、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即 得培养基。 优选地，所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤:取小麦蛋白粉，加入其重 量15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10mol/LHCL调节溶液pH值为2.0~4.0，加 入1200~1800U/g的酶，35~45°C下酶解6~10h，用1~2mol/LHCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶 解结束后95°C灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶 解物。本专利技术所述的酶解小麦蛋白的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋 白酶中的一种或多种。优选地，所述的酶解小麦蛋白的酶为胃蛋白酶。 优选地，所述酶解明胶溶液的制备方法包括如下步骤： S1:将明胶溶解在PBS溶液中，得到明胶PBS溶液，所述明胶PBS溶液的质量体积浓度为 200-400mg/mL； S2:将S1得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为 121°C、压力为 103.4KPa、时间为 20min; S3:将经S2处理后的明胶roS溶液冷却至常温，加入其体积0.5~2%的质量百分浓度为 0.25 %的胰酶溶液，在37°C温度下酶解24~36h; S4:将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至2-8°C，如出现凝固现象，则重复S3步骤，直至 在2-8°C时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:本专利技术提供了一种新的培养Marc-145细 胞用的无血清培养基。本专利技术提供的培养Marc-145细胞用的无血清培养基能促进Marc-145 细胞快速生长和增殖，同时，与传统的含血清培养基相比，本专利技术培养Marc-145细胞用的培 养基不含血清，动物源成分含量低，有效降低了后续病毒的纯化带来分离难度，同时也提高 了疫苗的安全性。此外，本专利技术的制备方法简单、易操作，便于实现大规模生产的需要。【具体实施方式】下面结合【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。实施例1本专利技术培养Marc-145细胞用的无血清培养基 一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其包括MEM培养基，还包括如下组分:胰岛 素样生长因子2yg/mL、表皮生长因子5yg/mL、成纤维生长因子8yg/mL、转铁蛋白5yg/mL、亚 硒酸钠20yg/mL、小麦蛋白酶解物5mg/mL、5%体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺1Oyg/mL。制备方法： s1:取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入1Omo1/LHCL调 节溶液pH值为3.0，加入1800U/g的酸性蛋白酶，40°C下酶解8h，用2mol/LHCL或NaOH保持溶 液pH值不变，酶解结束后95°C灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得 小麦蛋白酶解物； S2:将20g明胶溶解在90mL的roS溶液中，得到明胶roS溶液； S3:将S2得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为 121°C、压力为 103.4KPa、时间为 20min; S4:将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至常温，加入10mL质量百分浓度为0.25 %的胰酶 溶液，在37°C温度下酶解36h; S5:将经S4处理后的明胶PBS溶液冷却至4°C，如出本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培养Marc‑145细胞用的无血清培养基，其特征在于：包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子0.1~10μg/mL、表皮生长因子5~20μg/mL、成纤维生长因子0.1~10μg/mL、转铁蛋白5~20μg/mL、亚硒酸钠20~30μg/mL、小麦蛋白酶解物1~5mg/mL、1~5%体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺10~20μg/mL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，徐家华，张文炎，何芳，唐兆新，高艳，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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