一种贴壁细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞领域，特别涉及一种贴壁细胞的培养方法。该培养方法取所述贴壁细胞与微载体混合后培养，从所述微载体上剥离贴壁细胞，收集。本发明专利技术提供了一种在短时间内获得大量羊膜间充质干细胞的工艺，利用微载体为贴壁细胞在有限的空间内提供大量的生长面积，大规模扩增羊膜间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种贴壁细胞的培养方法
本专利技术涉及细胞领域，特别涉及一种贴壁细胞的培养方法。
技术介绍
1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是"非定位性"的，而且存在伦理道德等方面的问题。成体干细胞则不存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题，同时具有取材方便、来源广等优点，因而，成体干细胞在组织工程、基因治疗及个体化治疗的研究中具有很好的临床应用前景。大规模细胞培养生产力的提高可以通过在2-3×106cell/mL细胞密度下放大到大体积，或者通过在更小的体积内增大细胞密度来强化培养过程。提高细胞密度时，需要更频繁的更换培养液，最后还需要应用灌注培养。作为贴壁细胞的羊膜间充质干细胞因为培养空间的限制不能像悬浮细胞一样大规模的培养，微载体系统提供的极大的培养表面积/体积比率，提高了细胞产量而无需凭借大容量的设备。相对于其他类型的单层培养而言，微载体培养需要相当少的空间，就可生产大量的细胞，从而达到大规模培养的目的。现今，微载体主要的工业应用是生产疫苗，基因治疗的载体、天然和重组蛋白质以及不断增多的单克隆抗体，使用微载体技术的应用数目可能受生产细胞的选择和它的糖基化类型的影响。如果更多天然的贴壁细胞系被选择，则微载体技术的应用将会极大地增加。总的来说，以收获大量贴壁细胞为最终目的微载体培养技术是比较匮乏的。羊膜间充质干细胞用于临床、组织工程都需要大量的细胞。临床应用可达108-1010数量级。由于间充质干细胞需要贴壁生长，这种规模的细胞数量在实验室使用培养瓶扩增，耗材消耗量大，人工的付出也是惊人的。生物反应器通常用于大规模扩增细胞，但是通常生物反应器用于悬浮细胞的大规模扩增，而且是开放式系统，需要很多支持设备，不但操作复杂，还容易导致污染等问题，临床应用存在相当大的风险。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术通过研究发现，提高贴壁细胞培养密度的关键是有足够大的表面积以及培养基的补充，本专利技术利用微载体和生物反应器实现贴壁细胞高密度培养。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种贴壁细胞的培养方法，取所述贴壁细胞与微载体混合后培养，从所述微载体上剥离贴壁细胞，收集。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述微载体为Cytodex-3。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述微载体在培养贴壁细胞时的浓度为0.5～5.0mg/mL终体积。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述贴壁细胞的接种密度为0.5～2×105cells/mL。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述培养的温度为35.5℃。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述培养的pH值为7.00～7.15。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述培养时间为2～3d。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述剥离包括洗涤、酶消化的步骤。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述酶消化具体为加入与所述微载体等体积的0.25％(w/w)胰蛋白酶/EDTA[EDTA的工作液浓度为0.05％(w/w)]，10RPM搅拌15秒，静置1min，重复1次，以10RPM的搅拌速度加入2.5倍体积于胰蛋白酶的完全培养基终止消化。本专利技术还提供了胰酶/EDTA消化结合吹打的方法将贴壁细胞从微载体上剥离下来。凡是本领域的消化方式均在本专利技术的保护范围之内，本专利技术在此不做限定。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法中所述贴壁细胞为羊膜间充质干细胞。在本专利技术的一些具体实施方案中，1×107cell-500mL培养液-1g微载体-3天培养模式可扩增约16倍。扩增极限取决于微载体的量以及单个细胞平均贴壁面积。细胞与微载体结合方式：在接种细胞之前，平衡和稳定所有培养参数尤其是温度和pH，这示决定是否能结合完全的关键因数。含有培养基的培养容器在湿度95％、5％CO2的培养箱中于35.5℃温育平衡，30分钟之后，培养液就将适合于接种。接种时，使用指数生长期生命力旺盛的细胞，避免使用静止期的细胞。吸出无菌微载体中的PBS，用温热的培养基润洗一次。调整培养基的温度到35℃，确保培养液pH在7.05，取50mL2×105cell/mL细胞缓缓加入500mL含有2.0g/LCytodex3的上述温度和pH的培养液，以20RPM的搅拌速度在黑暗条件下搅拌2小时，之后在1小时之内将温度均匀升至37℃，搅拌速度提升至25RPM，调整pH在7.00～7.15，进入常规培养阶段。在前一天晚上孵育微载体，次日上午准备种子细胞后马上结合，下午17：00可第一次取样观察可准确知道结合情况。90％以上的细胞结合上微载体为佳。培养阶段：每天定时取样(09：00以及17：00)，不停止搅拌，用螺口注射器从生物反应器取样模块抽取约2mL样液，先测定pH，记录pH模块测定值和pH计测定值，以pH计测定为准，如果pH值在7.00～7.15之外，需要开启pH调节模块，控制pH在有效范围之内，在一次性培养过程中(2～3天)，未出现过pH超出范围的情况，连续培养需要一直开启pH调节模块和补液模块。测定完pH后取1mL均匀样液于EP管中，静置2min，吸弃上清，加入1mL的0.1mol/L柠檬酸-结晶紫染液(柠檬酸可将微载体溶解并破碎细胞膜，结晶紫染液可将细胞核染成深色)，吹打混匀，于37摄氏度环境孵育3小时，取10uL于血细胞计数板，在200倍下计数细胞核，以计数结果判断细胞增殖情况。另外1mL置于12孔培养板内，于倒置显微镜下观察微载体情况。培养成熟后细胞与微载体分离的方式：整个处理过程都要保证在37℃环境。停止搅拌，静置2min，可见微载体完全沉降，吸弃上清，用与微载体等体积的注射用生理盐水(提前预热至37℃)清洗2遍，清洗过程中采用10RPM搅拌15秒，然后加入等体积的0.25％胰蛋白酶/EDTA，10RPM搅拌15秒，然后静置1min，重复1次，以10RPM的搅拌速度加入2.5倍体积于胰蛋白酶的完全培养基终止消化，静置2min使微载体完全沉降，吸取上清过70um滤膜2次(可吸取少量临界层的微载体)，所得上清于1500RPM离心5min，即得到纯净细胞。第3天下午即可收获细胞，1×107cell-500mL培养液-1g微载体-3天培养模式可扩增约16倍。扩增极限取决于微载体的量以及单个细胞平均贴壁面积。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述洗涤为用与微载体等体积的注射用生理盐水(提前预热至37℃)清洗2遍，清洗过程中采用10RPM搅拌15秒。在本专利技术的一些具体实施方案中，结合微载体，利用生物反应器规模化制备间充质干细胞。生物反应器采用的玻璃罐且有多个功能模块可供选择，包括进/排气、补液系统、取样器、各种类型搅拌桨、热交换器等等，可根据实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种贴壁细胞的培养方法，其特征在于，取所述贴壁细胞与微载体混合后培养，从所述微载体上剥离贴壁细胞，收集。

【技术特征摘要】
1.一种贴壁细胞的培养方法，其特征在于，取所述贴壁细胞与微载体混合后培养，从所述微载体上剥离贴壁细胞，收集。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述微载体为Cytodex-3。3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述微载体在培养贴壁细胞时的浓度为0.5～5.0mg/mL终体积。4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述贴壁细胞的接种密度为0.5～2×105cells/mL。5.根据权利要求1至4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为35.5℃。6.根据权利要求1至5任一项所述的培养方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，黄幸，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44