本发明专利技术提供了一种针对VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法，包括步骤：取对数生长期的HUVEC细胞，调整至合适的细胞密度进行铺板，培养，使细胞贴壁；然后将参考品及供试品进行系列梯度稀释后依次加入铺好细胞的培养板中继续孵育一段时间；最后采用检测活细胞量或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应，并根据显色反应结果得出供试品的生物学活性。本发明专利技术可满足专属性、准确度、精密度(包括重复性，日间差，人员操作误差)等验证方面的要求，能够有效的应用于VEGF靶向治疗药物的筛选以及质量控制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种针对VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法。
技术介绍
血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子。它能够通过与血管内皮上的相应受体结合，促进内皮细胞增殖，并增加血管通透性，使内皮细胞迁移，诱导肿瘤血管生成，维持肿瘤的继续生长，是目前发现的最强的血管生成因子，与诸多生理及病理过程有关。已有研究证明，肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，分别是无血管的缓慢生长期和有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1-2mm，转移则无法实现，因此血管生成是恶性肿瘤生长中的一个重要过程，抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。因此，VEGF已成为具有良好前景的肿瘤治疗靶点。在药物的研制过程中，生物学活性检测方法是药物筛选以及质量控制的重要评价指标，该方法必须通过方法验证，满足专属性、精密度、准确度等方法验证方面的要求，这样才能保证生物学活性检测结果的可靠性，才能用于指导药物的筛选以及质量控制，因此建立切实可靠的生物学活性检测方法，对于VEGF靶向治疗药物的研究开发、质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。目前常用的针对VEGF靶向治疗药物的生物学活性测定方法，是依据VEGF能够促进细胞增殖分化，而药物可以中和VEGF活性，从而对细胞具有增殖抑制作用的原理进行实验设计的，使用的细胞系主要是HUVEC细胞，从文献报道来看，该细胞增殖抑制的生物学活性方法并未得到公认或标准化，由于HUVEC细胞属于原代细胞，细胞贴壁性不好，采用普通的细胞培养板，得不到可靠的实验结果，因此在实验过程中需要提前在96孔板预铺一层明胶以帮助HUVEC进行贴壁，并且明胶铺设的情况直接影响到细胞状态和实验结果，使得实验繁复且难以标准化。另外，显色方式和显色条件也各不相同，从文献报道来看，大多采用的是放射性同位素(3H-TdR)标记法、AlamarBlue或CelltiterGlo显色法，前者是同位素标记法，对环境和人员存在一定的辐射与伤害，不利于方法推广以及质量控制；AlamarBlue是一种荧光显色法，显色操作方便，但是实验必须采用不透明96孔细胞板进行实验，在实验过程中不便进行细胞状态的观察，并且复孔间RLU值的变异系数比较大；CelltiterGlo显色法是基于ATP的化学发光检测法，同样需要采用不透明96孔细胞板进行实验，不便于在实验过程中进行细胞状态的观察；此外，由于底物和缓冲液的储存条件为-20℃，因此显色前必须化冻，并且需要将底物与缓冲液混合恢复至室温才可以用于显色，配好的显色液在4℃的条件下只能稳定48小时。除此以外，更重要的是，在已经报道的针对VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法中，缺乏对检测体系专属性、精密度、准确度、线性和范围等方面的方法验证与评价，难以确保检测结果的准确性与可靠性。因此，一种能够简便、准确、高效地评价VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法仍是目前所急需的。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对现有VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法存在的问题与不足，研究了一种能够简便、准确、高效地评价VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法，该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确度、精密度(包括重复性、日间差、人员操作误差)、线性和范围等方面的要求，该方法对于VEGF靶向治疗药物的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。具体地，本专利技术公开了一种评价VEGF靶向治疗药物的生物学活性检测方法，包括下列步骤：(1)细胞铺板：取对数生长期的HUVEC细胞制成细胞悬液，分别加入细胞培养板孔中，然后将细胞培养板置于培养箱中培养，使细胞贴壁；(2)参考品及供试品稀释：取参考品及供试品，根据标示浓度，先预稀释至一定浓度，再进行系列梯度稀释；(3)VEGF稀释：按照标示浓度稀释至一定浓度，与步骤(2)稀释好的系列梯度浓度的参考品及供试品溶液进行等比例混合并预孵。(4)加样：将步骤(3)预孵溶液依次加入步骤(1)中的细胞培养板孔中，然后将细胞培养板置于培养箱中培养；(5)显色：采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应；(6)测定分析：步骤(5)显色反应完成后，取出细胞培养板混匀，放入酶标仪，对显色反应结果进行测定，并根据测定结果计算供试品的细胞增殖抑制生物学活性。优选地，步骤(1)所述的细胞铺板，是取对数生长期的HUVEC细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，计数并调整至合适的细胞密度，以100μl/孔加入96孔细胞培养板中，然后将细胞培养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，使细胞贴壁。步骤(4)所述加样，是将步骤(3)预孵溶液以100μl/孔依次加入步骤(1)所述的细胞培养板中，然后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养68-74小时。步骤(6)所述供试品细胞增殖抑制生物学活性是通过以下方法获得，用参考品孔和供试品孔测定值与加样浓度的量效关系进行4参数拟合，确定参考品与供试品的EC50值，曲线拟合常数R2，并按照下列公式计算供试品的细胞增殖抑制生物学活性：在一些实施例中，优选地，所述VEGF靶向治疗药物是单克隆抗体、融合蛋白、激酶抑制剂、反义寡核甘酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物之一或它们的任意组合，其中优选为单克隆抗体(贝伐珠单抗)和融合蛋白(VEGF-Trap)在一些实施例中，优选地，步骤(1)所述细胞培养板是一种对微孔板表面进行特殊处理过的细胞培养板，优选多聚赖氨酸表面涂覆处理和等离子技术表面亲水处理的96孔细胞培养板，这种经过表面特殊处理过的细胞板可促进细胞的吸附和贴壁，减少了明胶预铺板的复杂步骤，不但提高了工作效率，减少了实验影响因素，而且保证了实验的可靠性。在一些实施例中，优选地，步骤(2)所述的系列梯度稀释是倍比稀释，更优选所述的参考品溶液和供试品溶液浓度预稀释至1-20ug/mL。在一些实施例中，优选地，步骤(3)所述的VEGF稀释至一定浓度是50-300ng/mL。在一些实施例中，优选地，在步骤(5)中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系为包括但不限于：四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系等。更优选地，所述四唑类化合物为MTT、MTS、CCK-8等，最优选为CCK-8，改用CCK-8显色液，便于实验过程中进行细胞状态的观察，不需要进一步的溶解处理，避免了反复冻融对显色液灵敏度的影响，而且显色结果稳定，可操作性强，质量更加可控。。本专利技术采用的体外细胞增殖抑制法评价VEGF靶向治疗药物的生物学活性，该方法专属性好，特异性强，准确度高，线性和范围能够达到50—150％；精密度高、重复性、日间差以及人员操作误差RSD均小于20％，参考品和供试品的4参数拟合曲线的拟合常数R2均大于0.95。因此，采用本专利技术提供的方法能够简便，准确，高效地评价VE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对VEGF靶向治疗药物的生物活性检测方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)细胞铺板：取对数生长期的检定用细胞制成细胞悬液，分别加入细胞培养板孔中，然后将细胞培养板置于培养箱中培养，使细胞贴壁；(2)参考品及供试品稀释：取参考品及供试品，根据标示浓度，先预稀释至一定浓度，再进行系列梯度稀释；(3)VEGF稀释：按照标示浓度稀释至一定浓度，与步骤(2)稀释好的系列梯度浓度的参考品及供试品溶液进行等比例混合并预孵；(4)加样：将步骤(3)预孵的溶液依次加入步骤(1)中的细胞培养板孔中，然后将细胞培养板置于培养箱中培养；(5)显色：采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应；(6)测定分析：步骤(5)显色反应完成后，取出细胞培养板混匀，放入酶标仪，对显色反应结果进行测定，并根据测定结果计算供试品的细胞增殖抑制生物学活性。
【技术特征摘要】
1.一种针对VEGF靶向治疗药物的生物活性检测方法，其特征在于，包括下列
步骤：
(1)细胞铺板：取对数生长期的检定用细胞制成细胞悬液，分别加入细胞
培养板孔中，然后将细胞培养板置于培养箱中培养，使细胞贴壁；
(2)参考品及供试品稀释：取参考品及供试品，根据标示浓度，先预稀释
至一定浓度，再进行系列梯度稀释；
(3)VEGF稀释：按照标示浓度稀释至一定浓度，与步骤(2)稀释好的系
列梯度浓度的参考品及供试品溶液进行等比例混合并预孵；
(4)加样：将步骤(3)预孵的溶液依次加入步骤(1)中的细胞培养板孔
中，然后将细胞培养板置于培养箱中培养；
(5)显色：采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色
反应；
(6)测定分析：步骤(5)显色反应完成后，取出细胞培养板混匀，放入
酶标仪，对显色反应结果进行测定，并根据测定结果计算供试品的细胞增殖抑
制生物学活性。
2.根据权利要求1所述的生物活性检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的
细胞铺板是通过取对数的检定用细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，计数并
调整至合适的细胞密度，以100μl/孔加入96孔细胞培养板中，然后将细胞培
养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，使细胞贴壁。
3.根据权利要求2所述的生物学活性检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，
所述96孔细胞培养板是一种对微孔板表面进行特殊处理过的细胞培养板，优选
多聚赖氨酸表面涂覆处理和等离子技术表面亲水处理的96孔细胞培养板。
4.根据权利要求1所述的生物学活性检测方法，其特征在于，步骤(2)所述
\t系列梯度稀释是倍比稀释，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘培培，陈香，谭青乔，
申请(专利权)人：上海中信国健药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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