一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度测定方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度测定方法。具体地，发明专利技术公开了一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的测定方法，其中待测样品为人血清，待测样品的稀释液为已去除内源性TNFRII的正常人血清。本发明专利技术的方法使用的标准曲线及质控样品采用的稀释液更贴近人血清样品，同时又不具有正常人血清中天然存在的内源性TNFRII干扰，使得方法即具有更高的可靠性又具备更好的灵敏度。本发明专利技术还对上述方法的准确性、精密度、专属性等参数进行方法验证。本方法验证使用极少的实验对更多参数进行了验证，所验证的参数符合权利机构对血清样品检测的要求，并能涵盖血清样品检测中所可能遇到各种条件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地涉及一种人血清中重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度测定方法。
技术介绍
肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactor,TNF)，又叫恶病质因子(cachectin)，按其结构分两型：TNF-α和TNF-β，其中由活化的巨噬细胞、单核细胞和T细胞产生的能使肿瘤坏死的因子称为TNF-α；而把由活化的T细胞和NK细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin,LT)称为TNF-β。目前研究较多的是TNF-α，它是一种由157个氨基酸组成、相对分子质量为17kD的可溶性多肽，成熟型TNF-α的活性形式为三聚体。TNF-α具有广泛的生物学活性，对免疫细胞有活化、促增殖和分化等作用，例如：参与淋巴细胞的迁移、活化、增殖与分化以及淋巴组织的再生，对某些非肿瘤细胞和大多数肿瘤细胞具有诱导凋亡的作用，具有强大的抗肿瘤作用，是迄今发现的抗瘤作用最强的细胞因子，对肿瘤细胞具有直接的抑制增殖和细胞坏死作用。TNF-α对其他细胞(包括心肌细胞)的生长分化也有影响，同时还有抗病毒及细菌，激活T细胞，促进IL-1、IL-2、IL-6的产生及分泌，诱发炎症反应，促进IL-2R、EGFR等的表达等功能，在宿主防御反应中起重要作用。TNF-α具有双重生物学效应，在浓度较低时，TNF-α主要作为白细胞和内皮细胞的自分泌及旁分泌的调节物，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症反应，引起肿瘤细胞凋亡等；在高浓度时，过量的TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。TNF-α对众多的组织器官产生生物学效应，是细胞因子网络中一个重要的多功能成员，是机体维持内部自稳、抵御各种致病因子必不可少的免疫调节因子。TNF-α参与机体的多种病理生理过程，包括发热、炎症、创伤愈合、免疫调节、病毒复制、变态反应、胰岛素抵抗和肿瘤杀伤等。当机体处于病理状态时，TNF-α对清除受损细胞、维持机体内环境平衡起着重要的作用,是维持机体内部稳定、抵御各种致病因子必不可少的免疫调节因子。肿瘤坏死因子-α生产的失调被认为与许多人类疾病有关，包括阿兹海默氏症、癌症、重性抑郁障碍和肠炎。在某些免疫性疾病如：中重度类风湿关节炎、强直性脊柱炎、中重度寻常型银屑病中，肿瘤坏死因子-α水平升高，引起炎症反应。炎症得不到有效治疗，疾病就会发展，最终会造成骨和关节的破坏，以及银屑病皮损迁延不愈。TNF-α的生物学活性主要是通过细胞膜上的特异受体传递信号而实现的。TNF-α受体(TNFR)广泛存在于肝、肺、肾、肠道及肌肉组织中。TNF-α与靶细胞膜上的TNFR结合产生生物学效应，通过受体后效应将信息传递到胞核，使mRNA表达并进而合成蛋白质。TNF-α受体(TNFR)有2种，即相对分子质量分别为55000的TNFRI(p55)和75000的TNFRII(p75)，存在于多种正常及肿瘤细胞表面。两类TNFR均为糖蛋白，氨基酸顺序分析显示两类受体胞外区域的氨基酸顺序高度相似，但胞内区域则完全不同。TNFR与TNF-α和TNF-β的结合具有高度亲和力，其KD值均在pmol水平。由于各种细胞表达TNFR存在差异，使得TNF-α对各种细胞的作用不同，由此表现出其功能及其程度的多样性。一般来说，受体数目越高越容易受到TNF-α的损伤。TNF-α等细胞因子一方面与脏器细胞膜上的受体结合产生效应；另一方面，细胞因子与循环中的可溶性受体结合，使循环中的细胞因子减少,但在组织中的表达却增加，其在局部中的过度生成导致脏器损害。重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体Fc抗体融合蛋白(rhTNFRII：Fc)是一种采用基因重组技术生产的融合蛋白，其一端为TNFRII胞外区，一端为人IgG1的Fc端。它通过与可溶性、膜型TNF－a相结合，特异性阻断TNF－a与细胞表面受体的相互作用，阻断TNF－a介导的炎症反应，从而治疗因TNF-α失调所导致的类风湿关节炎、强直性脊柱炎及银屑病等自身免疫疾病。现有测定人血清中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的方法，一般为使用测定人II型肿瘤坏死因子受体的商业化试剂盒对人血清中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，其使用的稀释液均为ELISA实验常用稀释缓冲液，因此所配制出来的标准曲线、质控样品等均不含血清成分，与所测试样品的基质相差甚远，并不能保证测试的准确性；更糟糕的是，有的样品本身也需要使用稀释液进行稀释，如此下来则样品间基质组分都不一致，所测试结果可信度也就大打折扣。而在某些方法中，仅仅使用人血清质控样品及测试样品的稀释液，但由于血清中含高浓度的内源性II型肿瘤坏死因子受体，使得实验本底很高，方法的灵敏度往往达不到要求。因此，一种准确测定重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的测定方法仍是目前所急需的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种准确的测定人血清样品中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的方法。本专利技术的方法可克服方法验证及样品检测过程中做为样品稀释液的人血清中内源性可溶II型人肿瘤坏死因子受体对待测重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的背景干扰，提高方法的定量灵敏度。且本方法所使用标准曲线、质控样品及待测样品均使用同样的血清进行稀释，保证基质组分一致。具体地，专利技术公开了：1、一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的测定方法，其特征在于，待测样品为人血清，待测样品的稀释液为已去除内源性TNFRII的正常人血清。2、根据上述1所述的方法，其特征在于，所述去除内源性TNFRII的正常人血清是通过利用链霉亲和素偶联的磁珠及生物标记的抗TNFRII单克隆抗体纯化正常人血清获得。3、根据上述2所述方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用生物素标记抗TNFRII单克隆抗体；(2)使用链霉亲和素偶联的磁珠捕获步骤(1)所得的生物素标记的抗TNFRII单克隆抗体；(3)使用步骤(2)所得的捕获生物素标记抗TNFRII单克隆抗体的链霉亲和素偶联的磁珠纯化正常人血清，获得去除内源性TNFRII的正常人血清；(4)使用步骤(3)获得的去除内源性TNFRII的正常人血清作为稀释液稀释待测样品，测定待测样品中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度。4、根据上述3所述方法，其特征在于，步骤(4)所述重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人II型肿瘤坏死因子受体‑抗体融合蛋白浓度的测定方法，其特征在于，待测样品为人血清，待测样品的稀释液为已去除内源性TNFRII的正常人血清。

【技术特征摘要】
1.一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的测定方法，其特
征在于，待测样品为人血清，待测样品的稀释液为已去除内源性TNFRII的正常
人血清。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除内源性TNFRII的
正常人血清是通过利用链霉亲和素偶联的磁珠及生物标记的抗TNFRII单克隆抗
体纯化获得。
3.根据权利要求2所述方法，包括如下步骤：
(1)使用生物素标记抗TNFRII单克隆抗体；
(2)使用链霉亲和素偶联的磁珠捕获步骤(1)所得的生物素标记的抗
TNFRII单克隆抗体；
(3)使用步骤(2)所得的捕获生物素标记抗TNFRII单克隆抗体的链霉亲
和素偶联的磁珠纯化正常人血清，获得去除内源性TNFRII的正常人血清；
(4)使用步骤(3)获得的去除内源性TNFRII的正常人血清作为稀释液稀
释待测样品，测定待测样品中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(4)所述重组人II型肿瘤
坏死因子受...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄蔚，陈秋宇，谭青乔，
申请(专利权)人：上海中信国健药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31