一种融合蛋白分子量分析方法技术

本发明专利技术公开一种融合蛋白分子量分析方法，具体地，本发明专利技术公开一种用ESI-Q-TOF进行复杂糖基化融合蛋白准确分子量分析的方法，具体是一种利用特异性脱糖酶去除融合蛋白N-糖和唾液酸的样品前处理方法，处理后的融合蛋白经脱盐柱分离，流出液被ESI源碎裂成连续多电荷离子，经串联Q-TOF质谱分析、去卷积计算可获得含O-糖核心异构体的完整蛋白准确分子量。本发明专利技术的方法可克服N-糖和/或唾液酸对融合蛋白离子化效率的高度抑制，可准确测定含O-糖融合蛋白完整蛋白分子量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体地涉及一种蛋白分子量分析方法。
技术介绍
细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。融合蛋白糖基化修饰与其生物活性、结构和药代动力学均紧密相关，也会直接或间接影响其对蛋白酶的抗性、与Fc受体的结合、与补体C1q组份的相互作用、体内半衰期、相关生物学功能效应等。特定的糖基化修饰参与到重要的免疫细胞毒性效应因子功能中，也能通过与新生Fc伽马受体的结合来影响血清半衰期(RajuTS,ScallonBJ.GlycosylationintheFcdomainofIgGincreasesresistancetoproteolyticcleavagebypapain.BiochemicalBiophysicalResearchCommunications2006,341:797-803)(WrightA,SatoY,OkadaT,ChangK,EndoT,MorrisonS.InvivotraffickingandcatabolismofIgG1antibodieswithFcassociatedcarbohydratesofdifferingstructure.Glycobiology2000,10:1347-1355)。糖基化修饰对融合蛋白生物学功能是十分重要的，但复杂的糖基化修饰往往给蛋白结构表征分析带来相对于一般IgG1抗体更大的挑战。如依那西普每个单体Fc部分有1个N-糖位点，Fab部分有2个N-糖位点，另外据文献报道还含有13个O-糖位点(HouelS,HilliardM,YuY,McLoughlinN,MartinSM,RuddPM,etal.N-andO-GlycosylationAnalysisofEtanerceptUsingLiquidChromatographyandQuadrupoleTime-of-FlightMassSpectrometryEquippedwithElectron-TransferDissociationFunctionality.AnalyticalChemistry2013；86:576-584)。rhCTLA4-Ig每个单体Fc部分也有1个N-糖位点，Fab部分有2个N-糖位点(BongersJ,DevincentisJ,FuJ,HuangP,KirkleyDH,LeisterK,etal.CharacterizationofglycosylationsitesforarecombinantIgG1monoclonalantibodyandaCTLA4-Igfusionproteinbyliquidchromatographymassspectrometrypeptidemapping.JournalofChromatographyA2011；1218:8140-9)，另外有2个O-糖位点。分子量分析可以在宏观水平上对蛋白进行表征，可以在分子量水平确认蛋白表达是否正确，同时也可以确认蛋白的不同异构体修饰形态及比例，为进一步确认蛋白在肽段水平上变化提供直观的线索和依据。由于唾液酸以及Fab段上的N-糖对融合蛋白完整蛋白离子化效率抑制十分明显，一般文献报道均采用特异性酶如Ides和木瓜蛋白酶Papain将Fc段部分从完整单体上切下来分离后再进行分子量分析(TanQ,GuoQ,FangC,WangC,LiB,WangH,etal.CharacterizationandcomparisonofcommerciallyavailableTNFreceptor2-Fcfusionproteinproducts.MAbs2012；4:761-74)；(LynaughH,LiHandGongB.RapidFcglycosylationanalysisofFcfusionswithIdeSandliquidchromatographymassspectrometry.MAbs2013；5:761-74)。因此，如何有效的对融合蛋白进行完整蛋白分子量分析仍是目前急需的解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种融合蛋白完整分子量分析方法，该方法克服了现有技术中N-糖和唾液酸对融合蛋白完整蛋白分子量分析时离子化效率的抑制，能准确测定去除N-糖和唾液酸后含O-糖核心的融合蛋白的分子量。本专利技术是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤：1、融合蛋白N-糖(N-Glycosylations)去除；2、融合蛋白唾液酸(SialicAcid)去除；3、ESI-Q-TOFMS分析，去卷积计算。其中，步骤1与2先后顺序可以互换。更具体地，本专利技术公开了：一种融合蛋白分子量分析方法，所述方法包括步骤：(1)融合蛋白N-糖去除和/或唾液酸去除；(2)对去除N-糖和/或唾液酸的融合蛋白进行分子量分析。进一步地，专利技术公开了一种融合蛋白分子量分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)融合蛋白N-糖去除，(2)融合蛋白唾液酸去除，(3)对去除N-糖和唾液酸的融合蛋白进行分子量分析；其中，上述步骤(1)和(2)顺序可以互换。优选地，融合蛋白N-糖去除时溶液pH值为7.0～8.0；唾液酸去除时溶液pH值为4.0～7.0。更优选地，所述pH值是通过酸性或碱性可挥发性溶液调节。在一些具体实施例中，所述融合蛋白N-糖去除通过以下方法实现：取融合蛋白样品，加入缓冲液(例如：NH4HCO3或1％NH3.H2O)调节pH值至7.0～8.0，加入肽N-糖苷酶F，混匀后，37℃孵育24小时。在一些具体实施例中，所述融合蛋白唾液酸去除通过以下方法实现：取融合蛋白样品，加入缓冲液(例如：NH4HCO3或1％FA(FA：甲酸))调节pH值至4.0～7.0，加入唾液酸酶，37℃孵育24小时。优选地，所述融合蛋白的分子量是通过ESI-Q-TOFMS方法进行分析。在一些具体实施例中，所述ESI-Q-TOFMS分析采用以下方法实现：将融合蛋白用50mMNH4HCO3(pH8.0)溶液稀释至1mg/mL；然后脱盐柱(优选MassPREPTMMicroDesaltingColumn,20μm，2.1×5mm,Waters公司)脱盐；最后进行质谱分析。在一些实施例1～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白分子量分析方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)融合蛋白N‑糖去除和/或唾液酸去除；(2)对去除N‑糖和/或唾液酸的融合蛋白进行分子量分析。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白分子量分析方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)融合蛋白N-糖去除和/或唾液酸去除；
(2)对去除N-糖和/或唾液酸的融合蛋白进行分子量分析。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)融合蛋白N-糖去除，
(2)融合蛋白唾液酸去除，
(3)对去除N-糖和唾液酸的融合蛋白进行分子量分析；
其中，上述步骤(1)和(2)顺序可以互换。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，融合蛋白N-糖去除时溶
液pH值为7.0～8.0。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，融合蛋白唾液酸去除时
溶液pH值为4.0～7.0。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述融合蛋白N-糖去除
通过以下方法实现：取融合蛋白样品，加入NH4HCO3或1％NH3.H2O
调节pH值至7.0～8.0，加入肽N-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕锋华，刘周阳，环民霞，黄黎明，谭青乔，
申请(专利权)人：上海中信国健药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31